Estrategias de purificación para la recuperación de peroxidasa recombinante a partir de larvas de lepidópteros.

ALEXANDRA TARGOVNIK; LUCIA ROMERO; WOLMAN FEDERICO; OSVALDO CASCONE; MIRANDA MARÍA VICTORIA

Costa Salguero, CABA, Argentina.

Congreso; XII Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial; 2009

Introducción y objetivo: La expresión de proteínas recombinantes en larvas de lepidópteros infectadas con baculovirus recombinantes permite la obtención de enzimas de interés comercial con alto rendimiento y a bajo costo. Rachiplusia nu y Spodoptera frugiperda son plagas agrícolas ampliamente distribuidas en regiones tropicales y subtropicales de América. La mayor desventaja de la producción de proteínas recombinantes a partir de cultivos celulares de insectos a gran escala son los elevados costos. Por esta razòn, la utilización de las larvas como biofábricas resultan una interesante alternativa. Un proceso biotecnològico basado en larvas de insectos debe estar acoplado a un método efectivo y económico de Downstream processing. La isoenzima C de peroxidasa de Armoracia rusticana (HRP) es una enzima que tiene múltiples aplicaciones en diferentes àreas (producción de anticuerpos conjugados, tratamiento de efluentes, biosensores.).El objetivo de este trabajo fue optimizar y comparar los niveles de recuperación y pureza de la HRP recombinante expresada en larvas de R. nu y S.  frugiperda por cromatografía de intercambio ionico (IEC) y cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC). Materiales y Métodos: Se utilizó un baculovirus recombinante (vAcHRP) que presentaba el cDNA del gen HRPC, flanqueado por dos etiquetas, una de 6 residuos de histidinas en el extremo amino y otra de 6 argininas hacia el extremo carboxilo. Larvas de Rachiplusia nu y Spodoptera frugiperda del 5º estadio fueron infectadas con el baculovirus recombinante. Para la inoculación, las larvas fueron anestesiadas por inmersión en un baño de agua helada durante 10 min y se inyectaron con 50 ml de suspensión viral de alto título (@107 pfu/ml) vía subcutánea. Luego de una hora post-inyección las larvas fueron  llevadas al cuarto de cría y alimentadas con una dieta artificial. Al 4to d.p.i (Rachiplusia nu) y al 6to d.p.i (Spodoptera frugiperda) se cosecharon las larvas. Se purificó el producto por IMAC. Se realizaron los respectivos extractos de larvas por homogeneización en buffer de fosfatos de sodio 0,05 M, pH 6, EDTA 5 mM, KCl 0,15 M con agregado de cristales de glutatión y posterior centrifugación de las muestras a 10000 x g durante 10 min. Posteriormente se preacondicionaron las muestra a través de una columna de exclusión molecular pD10 en buffer de fosfatos de sodio 25 mM, pH 8, NaCl 300 mM.  Se purificó el producto en una columna Ni HisTrap de 1 ml de volumen de lecho  previamente equilibrada. Se trabajó a un flujo de 0,4 cm min -1 y se eluyó la enzima por agregado de imidazol 250 mM. Por otro lado se purificó el producto por IEC. Se realizaron los respectivos extractos en buffer Tris-HCl 0,05 mM pH 7 (buffer de equilibración) al cual se le agregó cristales de glutation. Las muestras fueron sembradas directamente en columnas SP-HiTrap de 1 ml de volumen de lecho previamente equilibrada. Se trabajó a un flujo de 0,4 cm min -1 y se realizó una cromatografía en step por el agregado creciente de NaCl al buffer de equilibración (25, 150, 500 mM). Se monitorearon las cromatografías a 280 nm y se determinó actividad enzimática por un método cinético empleando guayacol como sustrato. Se analizó el producto purificado por SDS-PAGE y Western Blot. Se determinaron los parámetros (Km y Vmax). Resultados: La concentración de HRPC en larvas Spodoptera frugiperda resulto ser al 6to dpi de 137±17 mg/Kg de larva. Se logro por IMAC un índice de purificación (IP) de 29,23 con un rendimiento del 86%. Mientras que por IEC se logró un IP de 117 con un rendimiento del 75% en el pico de elusión correspondiente a 150 mm NaCl. Por otro lado la concentración de HRPC en larvas de Rachiplusian nu resulto ser al 4to dpi de 100 ±  mg/Kg larva. Se logró purificar por IMAC obteniéndose un IP de 13,2 y un rendimiento del 89,2%. Sin embargo por IEC se obtuvo un IP de…. con una recuperación de… en el pico de elusión correspondiente a …de NaCl. La Km y Vmax obtenida fue de  12.1 ± 1.7 mM and 2673 ± 113 U mg-1 respectivamente para las HRPC proveniente de Spodoptera frugiperda  mientras que en el caso de la HRPC purificada de larvas de Rachiplusia nu fue 17,3 ± 2 mM y 2778,4 ± 116,4 U mg-1. Valores similares se obtuvieron para HRPC standard de origen vegetal, 18,8 ± 2,15 mM y 3102,3 ± 67,8 U mg-1. Conclusión: De los resultados expuestos se puede concluir que es posible purificar exitosamente la HRPC  proveniente de ambas larvas aprovechándose ambos tags incluidos en la construcción genética. Se obtuvieron factores de purificación superiores por IEC que por IMAC logrando obtener un esquema de purificación simple, económico y escalable.