Diseño de un proceso de producción de peroxidasa en larvas de Rachiplusia nu infectadas con baculovirus.

LOUSTAU, MARÍA; LEVIN, GUSTAVO; MAGRI, MARÍA LAURA; TABOGA, OSCAR; CASCONE, OSVALDO; MIRANDA, MARÍA VICTORIA

Bs. As.

Congreso; VIII Congreso Argentino de Virología; 2005

La peroxidasa de rábano picante (HRP) es una enzima con actividad oxidorreductasa cuyo principal mercado deriva de su conjugación a anticuerpos y/o antígenos para su utilización en técnicas de inmunoanálisis, inmunohistoquímica, etc. Su fuente tradicional está constituída por las raíces de A. rusticana (rábano picante). Esta enzima no se produce en nuestro país debido a la escasez de la materia prima, por lo cual toda la peroxidasa utilizada es de origen importada. La HRP es una hemoproteína altamente glicosilada, estabilizada por 4 puentes disulfuro, cuya obtención como proteína recombinante en sistemas de origen procariota se ve complicada por sus características estructurales. Un sistema eucariota interesante para la obtención de este biocatalizador es la expresión en células de insectos. Hemos expresado 20 mg/L de HRP en sobrenadante de cultivo en líneas celulares de Spodoptera frugiperda (SF21) infectadas con baculovirus recombinante (AcGP67HRP) al 6° día postinfección. La enzima se modificó genéticamente de manera de aumentar su punto isoeléctrico mediante el agregado de 6 residuos de argininas en el extremo carboxilo (HRP6xarg). Esto último permite la purificación directa de la HRP a partir de medio de expresión en cromatografía de intercambio iónico. El objetivo de este trabajo fue diseñar un esquema de expresión y purificación de HRP en  larvas de insectos (Rachiplusia nu) y compararlo con el proceso en líneas celulares. El baculovirus recombinante contiene el gen de HRPC6xarg bajo el control de promotor de poliedrina y al secuencia señal de secreción GP67 de Autographa californica. Se amplificó un clon viral y se preparó un stock de trabajo de título 4,4.107 ufp/ml. Se infectaron larvas en distintos estadios con el baculovirus recombinante por vía subcutánea (3,3.106 partículas/oruga en un volumen de 50 ml. Al 3° día postinfección, se colectó hemolinfa y se prepararon extractos totales de las orugas con el fin de evaluar la expresión y la localización de la enzima. Para ello se ensayaron distintos buffers de extracción con el objeto de detener el proceso de melanización que se produce frente en las muestras obtenidas. Se ensayaron diferentes buffers con distintas concentraciones de bmercaptoetanol (0,5 -10 mM), EDTA (1-5 mM), DTT (1-30 mM), PMSF (0 y 0,5 mM) y el agregado de cristales de glutatión y sales (NaCl, KCl). El buffer óptimo resultó ser Buffer de Fosfatos de Na 0,05 M pH 6,0, EDTA 5 mM, KCl 0,15 M y cristales de glutatión. Se determinó por geles nativos de poliacrilamida la presencia de una banda de peso molecular correspondiente a la HRP nativa y de alto punto isoeléctrico (PI > 9,5) tanto en muestras de extracto total como en hemolinfa de larvas infectadas. Larvas de 150-160 mg de peso se homogeneizaron con 0,4 ml de buffer de extracción y se centrifugaron a 13000 rpm durante 15 min a temperatura ambiente. Se obtuvo 0,67 mgHRP/g larva (6-7 larvas). Los resultados obtenidos permiten concluir que el sistema de larvas de Rachiplusia nu  infectadas con baculovirus recombinante es altamente eficiente para la expresión de HRP. El nivel de expresión en larvas es entre 35-40 veces superior al obtenido en líneas celulares. Por otra parte, el costo global del proceso se reduce notablemente. Este esquema de trabajo puede aplicarse a cualquier otra proteína de interés comercial.