INVESTIGADORES
MIRANDA Maria Victoria
congresos y reuniones científicas
Título:
PRODUCCIÓN Y EVALUACIÓN DE ANTICUERPOS IgY DE GALLINA ANTI-IgG DE BOVINO CONJUGADOS A PEROXIDASA DE SOJA
Autor/es:
GUSTAVO ASENZO; GUSTAVO LEVIN,; GUTIERREZ G; LAUTARO BRACCO; VIVIANA PARREÑO; TRONO K; MARIA V MIRANDA; ANDRES WIGDOROVITZ
Reunión:
Congreso; XI Congreso Argentino de Virología II Congreso Latinoamericano de Virología IV Simposio de Virología Clínica II Simposio de Virología Veterinaria ?Dr. José L. La Torre?; 2015
Institución organizadora:
AAM
Resumen:
Introducción: Los anticuerpos conjugados a peroxidasa son utilizados rutinariamente en diagnóstico. Su producción es sencilla, sin embargo es necesario el sangrado de animales para la obtención de los anticuerpos y disponer de la enzima en cantidad y bajo costo para su marcación. Para superar estas limitaciones, nos planteamos producir anticuerpos IgY anti-IgG bovino (H+L) a partir de yema de huevo y purificar peroxidasa a partir de la cáscara de soja (SbP), para finalmente conjugar estas moléculas. Metodología: Se hiperinmunizaron gallinas de raza Brown Nick con IgG bovina durante 2 meses. Se comprobó la respuesta inmune en los animales. Se recolectaron los huevos, se separó la yema y se extrajo la fase soluble de la yema por dilución en H2O y congelación. Se precipitó la IgY con sulfato de amonio y se purificaron los anticuerpos específicos por cromatografِía de afinidad a IgG bovina. Paralelamente, se purificó la SbP por cromatografía de intercambio iónico y de interacción hidrofóbica. Se conjugó la IgY a la SbP por medio de una reacción con periodato de sodio y una vez obtenido el conjugado IgY-SbP, se lo tituló en el ELISA indirecto para Leucosis Bovina Enzoótica (LBE), ensayo ya estandarizado en nuestro Instituto, en diluciones seriadas; para analizar su performance. Por último, se analizaron muestras de campo utilizando un conjugado comercial y el producido en nuestro laboratorio.Resultados: Se logró obtener por medio de una hiperinmunización de gallinas un título de anticuerpos IgY anti-IgG de bovino con una dilución 1/262000 a punto final del suero. Se obtuvo un rendimiento de 2 mg de IgY específica por huevo. Se puso a punto la conjugación de esta IgY con la SbP, usando 160 mM NaIO4 para la oxidación de la enzima y 100 mM de NaBH4 para el bloqueo de la reacción. Se comprobó la marcación de la inmunoglobulina en una placa de ELISA sensibilizada con IgG de bovino. Se analizó la eficiencia de la marcación por medio de un SDS-PAGE. El conjugado obtuvo un título en el ELISA para LBE con la dilución de uso de 1/1000. La comparación estadística de los resultados utilizando muestras de campo mostró que el conjugado IgY-SbP tuvo un comportamiento semejante al conjugado comercial.Conclusiones: Se logró estandarizar el protocolo de marcación de las IgY. Se alcanzó una eficiencia de marcación y un título de uso comparable a las observadas en anticuerpos marcados con peroxidasa comercial. Se consiguió realizar el primer lote de anticuerpos conjugados IgY de gallina anti-IgG de bovino. Se empleó este reactivo en el ELISA estandarizado de LBE con resultados promisorios. Estos resultados positivos son un aliento para la evaluación del conjugado en otros métodos de diagnóstico en que se use anticuerpos anti-IgG bovina conjugado a peroxidasa. En un primer ensayo realizado con este reactivo, se obtuvo una performance aceptable para el uso en el laboratorio.