INVESTIGADORES
MIRANDA Maria Victoria
congresos y reuniones científicas
Título:
Plataforma biotecnológica integrada para la producción y purificación de antígenos del virus del dengue en células de insecto
Autor/es:
SMITH; URTASUN NICOLÁS; CEREZO; MIRANDA ; RODRIGUEZ TALOU
Reunión:
Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos (SAProBio 2014); 2014
Resumen:
IntroducciónEl Dengue es una de las enfermedades virales más importantes a nivel mundial en términos de morbilidad y mortalidad. La Organización Mundial de la Salud calcula que cada año se producen entre 50 y 100 millones de infecciones en el mundo y esta enfermedad es ahora endémica en más de 100 países tropicales y subtropicales. Pese a esto no existe aún una vacuna en el mercado ni fármacos antivirales específicos contra el Dengue.La glicoproteína de la Envoltura (E) forma parte de la envoltura viral y constituye la principal proteína estructural de los Flavivirus. Esta proteína media la unión del virus a las células y su entrada, siendo por esto el principal target para vacunas y antigripales. El Dominio III (DomIII) de la proteína E del virus del Dengue es el domino implicado en la unión a los receptores celulares. Este dominio contiene epitopes que generan anticuerpos neutralizantes serotipo específicos y es más fácil de producir en sistemas recombinantes por su menor tamaño.Recientemente, las hidrofobinas (HFB), proteínas anfifílicas de entre 7.5?10 kDa producidas por hongos filamentosos, han sido descriptas como eficientes proteínas de fusión para la purificación de proteínas recombinantes en bioprocesos. Debido a sus características, las proteínas fusionadas a ellas ven alteradas su hidrofobicidad y pueden ser separadas fácilmente en sistemas de dos fases acuosas (ATPS) basados en surfactantes no iónicos. La fusión proteica particiona en la fase del surfactante mientras que la mayoría de las proteínas lo hacen en la fase acuosa. De esta forma, en un sencillo paso de purificación se obtiene un buen rendimiento de la proteína recombinante fusionada a HFB con un alto grado de pureza. En general, los ATPS son rápidos, sencillos, de bajo costo y fáciles de escalar. Por otro lado, las hidrofobinas permiten la inmovilización de los antígenos fusionados a ellas en soportes sólidos comúnmente empleados en el diseño de kits de diagnóstico, de manera eficiente y correctamente orientados.El objetivo de este trabajo es el desarrollo de una plataforma integrada de producción y purificación de antígenos del virus del Dengue utilizando el sistema baculovirus/células de insecto. Para ello, se propone expresar la proteína E truncada (Et) y su DomIII como proteínas de fusión a HFB para una fácil y económica purificación por sistemas de dos fases acuosas. Ambas proteínas poseen una potencial aplicación biotecnológica orientada hacia la obtención de una vacuna de subunidades y también en el desarrollo de kits de diagnóstico.MetodologíaConstrucción de los vectores de transferencia: Se obtuvieron por overlapping PCR los cassettes de expresión para las proteínas Et (versión truncada de la proteína E a la que le falta la porción transmembrana para que se exprese en forma soluble) y DomIII fusionadas a HFB. En ambas construcciones se agregó una secuencia de reconocimiento para la proteasa TEV para la remoción de HFB. Estos fueron clonados en el vector de transferencia pAcGP67-B, que contiene el péptido señal de la glicoproteína acídica gp67 para la secreción de las proteínas al medio extracelular, bajo el promotor fuerte de poliedrina viral. La proteína GFP fusionada a HFB también fue clonada en este vector de transferencia para utilizarla como control de expresión y purificación.Obtención de los baculovirus recombinantes: Se obtuvieron tres baculovirus recombinantes por cotransfección de los tres vectores de transferencia con el ADN viral BaculoGoldTMBright (Pharmingen) en la línea celular Sf9. Los mismos fueron amplificados para obtener stocks virales de alto título y titulados por la técnica del punto final.Expresión: Se llevó a cabo la puesta a punto de la expresión de las proteínas recombinantes infectando cultivos de células Sf9 con los baculovirus recombinantes. Se probaron distintas multiplicidad de infección (moi 0.5 y 2) y se evaluó la cinética de expresión tanto en el medio de cultivo como intracelular con el fin de determinar las condiciones óptimas de expresión.Detección y análisis de las proteínas recombinantes: Se llevó a cabo por SDS-PAGE y Western Blot, probando diferentes buffers de extracción para el análisis de la expresión intracelular.Purificación: La purificación se llevó a cabo por ATPS utilizando el surfactante no iónico Tritón X-114. La recuperación de las proteínas recombinantes de la fase surfactante se realizó por medio del agregado de isobutanol (solvente no desnaturalizante).ResultadosSe obtuvieron los vectores de transferencia y con ellos los baculovirus recombinantes para la expresión en células de insecto de la proteína Et del virus del Dengue y su DomIII fusionadas a HFB. Si bien la expresión estaba dirigida al medio extracelular, se vio que la proteína EtHFB no fue liberada, siendo retenida en el interior de las células. Las condiciones óptimas para esta proteína fueron infección con moi 0.5 y cosecha a los 2 días post infección (dpi). Para la proteína DomIIIHFB se vio que se libera en parte al medio de cultivo, si bien queda parte retenida en el interior celular. Las condiciones óptimas para esta proteína fueron infección con moi 0.5 y cosecha a los 4 dpi. La extracción de la proteína EtHFB del interior celular sólo fue posible utilizando un buffer con alto contenido de SDS, lo cual no permite su posterior purificación por ATPS. Actualmente se están ensayando buffers alternativos o acondicionamientos posteriores que sean compatibles con la estrategia de purificación propuesta. DomIIIHFB fue exitosamente extraída del interior celular con buffer sin SDS y por lo tanto compatibles con ATPS. Logramos purificar parcialmente esta proteína del medio de cultivo por ATPS utilizando Tritón X-114 al 5%. Actualmente estamos optimizando esta estrategia de purificación.ConclusionesLos resultados expuestos en el presente trabajo indican que el sistema de expresión baculovirus/células de insecto resulta adecuado para la producción de antígenos del virus del Dengue como proteínas de fusión con Hidrofobina permitiendo de esta manera su purificación por medio de sistemas de dos fases acuosas de manera fácil y económica. El hecho de que DomIIIHFB sea liberada al medio de cultivo hace que su purificación sea más sencilla por presentar ese medio menos contaminantes que los extractos celulares. Logramos purificar exitosamente DomIIIHFB por ATPS. Estamos poniendo a punto la extracción de los antígenos del interior celular y su posterior purificación.
rds']