Participación del citoesqueleto de microtúbulos en la replicación del virus Pixuna

MLEWSKI, C; CRESPI, G; MARTINEZ,L; PAGLINI, S; PAGLINI G

Capital Federal - BsAs Argentina

Congreso; VIII Congreso Argentino de Virología; 2005

Sociedad Argentina de Virología

Participación del citoesqueleto de microtúbulos en la replicación del virus Pixuna E. Mlewski, G. Crespi, L. Martinez, S. Paglini, G. Paglini . Instituto de Virología J.M Vanella, Facultad de Ciencias Médicas, Córdoba. cmlewski@yahoo.com.ar El virus Pixuna (vP) (Alphavirus) presenta un genoma de ARN de cadena simple, replicación perinuclear y liberación por brotación. Posee proteínas estructurales de la cápside (C) y de envoltura (E1 y E2). Diversos estudios han demostrado que los microtúbulos y sus proteínas asociadas están involucrados en etapas tempranas y tardías de la replicación de virus animales, como Polyomavirus, Citomegalovirus, etc. Así, la depolimerización de microtúbulos, mediante el uso de drogas, afecta el proceso de transporte y salida de los viriones. En éste trabajo se analizó la posible participación del citoesqueleto de microtúbulos en la replicación del vP.La infección de la célula huésped con vP afecta su morfología, éstas se redondean, los filamentos de actina se desorganizan formando un cinturón subcortical y los microtúbulos se disponen en forma concéntrica hacia el interior de la célula. Para examinar el papel de los microtúbulos en el proceso de ensamble y brotación del vP, células Vero fueron infectadas con vP y el medio de cultivo fue suplementado con nocodazol (droga depolimerizante) y taxol (estabilizante). Los sobrenadantes fueron tomados a diferentes horas post-infección y los títulos infectivos se determinaron por ensayo de placa, mostrando una significativa disminución de los títulos virales a partir de las 8hs post-infección, llegando a reducirse un 80% a las 24hs. Para determinar si los microtúbulos son requeridos para el movimiento del vP desde su sitio de replicación hacia la membrana plasmática, las células fueron incubadas con nocodazol o taxol a las 6hs post-infección, tiempo en el que las proteínas virales ya han sido sintetizadas, y por un lapso de 18hs. El análisis mostró gran cantidad de partículas virales presente en el citoplasma y en la región perinuclear debido, probablemente, a la inhibición en el transporte de proteínas y/o los viriones hacia la membrana plasmática. Cuando el nocodazol (droga reversible) es removido del medio de cultivo, se observa que los microtúbulos adoptan la forma característica de una célula infectada en un estadio tardío, dando lugar a la progresión de la infección. Por inmunofluorescencia observamos aumento en la inmunomarcación de proteínas virales en el citoplasma, esto podría deberse a que al recuperarse los microtúbulos, las partículas virales pueden completar su ciclo normal y así brotar e infectar células vecinas. Para determinar la posible asociación de las proteínas del vP con los microtúbulos, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación de tubulina a partir de un lisado de células Vero infectadas. La proteína E2 coinmunoprecipita con tubulina, mientras que las proteínas E1 y C no están presentes. A su vez, por inmunofluorescencia observamos una fuerte colocalización entre los microtúbulos y las proteínas virales. Nuestros resultados sugieren una interacción entre la proteína E2 de la envoltura del vP con los microtúbulos, quienes participarían en el movimiento de ésta proteína hacia sus sitios de localización final para permitir la brotación de los viriones. El tratamiento de las células infectadas con nocodazol o taxol previene la progresión de la infección, sugiriendo que un citoesqueleto de microtúbulos intacto es esencial para que el vP replique, ensamble y brote de la célula. El tratamiento con nocodazol, después de la síntesis de las proteínas virales, inhibe el progreso de infección y la liberación del virus ya que al lavar la droga, se restablece la salida de los viriones. Estos resultados apoyan la idea de que los microtúbulos estarían involucrados en el transporte de las proteínas virales o los viriones hacia sus sitios de liberación final. El virus Pixuna (vP) (Alphavirus) presenta un genoma de ARN de cadena simple, replicación perinuclear y liberación por brotación. Posee proteínas estructurales de la cápside (C) y de envoltura (E1 y E2). Diversos estudios han demostrado que los microtúbulos y sus proteínas asociadas están involucrados en etapas tempranas y tardías de la replicación de virus animales, como Polyomavirus, Citomegalovirus, etc. Así, la depolimerización de microtúbulos, mediante el uso de drogas, afecta el proceso de transporte y salida de los viriones. En éste trabajo se analizó la posible participación del citoesqueleto de microtúbulos en la replicación del vP.La infección de la célula huésped con vP afecta su morfología, éstas se redondean, los filamentos de actina se desorganizan formando un cinturón subcortical y los microtúbulos se disponen en forma concéntrica hacia el interior de la célula. Para examinar el papel de los microtúbulos en el proceso de ensamble y brotación del vP, células Vero fueron infectadas con vP y el medio de cultivo fue suplementado con nocodazol (droga depolimerizante) y taxol (estabilizante). Los sobrenadantes fueron tomados a diferentes horas post-infección y los títulos infectivos se determinaron por ensayo de placa, mostrando una significativa disminución de los títulos virales a partir de las 8hs post-infección, llegando a reducirse un 80% a las 24hs. Para determinar si los microtúbulos son requeridos para el movimiento del vP desde su sitio de replicación hacia la membrana plasmática, las células fueron incubadas con nocodazol o taxol a las 6hs post-infección, tiempo en el que las proteínas virales ya han sido sintetizadas, y por un lapso de 18hs. El análisis mostró gran cantidad de partículas virales presente en el citoplasma y en la región perinuclear debido, probablemente, a la inhibición en el transporte de proteínas y/o los viriones hacia la membrana plasmática. Cuando el nocodazol (droga reversible) es removido del medio de cultivo, se observa que los microtúbulos adoptan la forma característica de una célula infectada en un estadio tardío, dando lugar a la progresión de la infección. Por inmunofluorescencia observamos aumento en la inmunomarcación de proteínas virales en el citoplasma, esto podría deberse a que al recuperarse los microtúbulos, las partículas virales pueden completar su ciclo normal y así brotar e infectar células vecinas. Para determinar la posible asociación de las proteínas del vP con los microtúbulos, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación de tubulina a partir de un lisado de células Vero infectadas. La proteína E2 coinmunoprecipita con tubulina, mientras que las proteínas E1 y C no están presentes. A su vez, por inmunofluorescencia observamos una fuerte colocalización entre los microtúbulos y las proteínas virales. Nuestros resultados sugieren una interacción entre la proteína E2 de la envoltura del vP con los microtúbulos, quienes participarían en el movimiento de ésta proteína hacia sus sitios de localización final para permitir la brotación de los viriones. El tratamiento de las células infectadas con nocodazol o taxol previene la progresión de la infección, sugiriendo que un citoesqueleto de microtúbulos intacto es esencial para que el vP replique, ensamble y brote de la célula. El tratamiento con nocodazol, después de la síntesis de las proteínas virales, inhibe el progreso de infección y la liberación del virus ya que al lavar la droga, se restablece la salida de los viriones. Estos resultados apoyan la idea de que los microtúbulos estarían involucrados en el transporte de las proteínas virales o los viriones hacia sus sitios de liberación final. El virus Pixuna (vP) (Alphavirus) presenta un genoma de ARN de cadena simple, replicación perinuclear y liberación por brotación. Posee proteínas estructurales de la cápside (C) y de envoltura (E1 y E2). Diversos estudios han demostrado que los microtúbulos y sus proteínas asociadas están involucrados en etapas tempranas y tardías de la replicación de virus animales, como Polyomavirus, Citomegalovirus, etc. Así, la depolimerización de microtúbulos, mediante el uso de drogas, afecta el proceso de transporte y salida de los viriones. En éste trabajo se analizó la posible participación del citoesqueleto de microtúbulos en la replicación del vP.La infección de la célula huésped con vP afecta su morfología, éstas se redondean, los filamentos de actina se desorganizan formando un cinturón subcortical y los microtúbulos se disponen en forma concéntrica hacia el interior de la célula. Para examinar el papel de los microtúbulos en el proceso de ensamble y brotación del vP, células Vero fueron infectadas con vP y el medio de cultivo fue suplementado con nocodazol (droga depolimerizante) y taxol (estabilizante). Los sobrenadantes fueron tomados a diferentes horas post-infección y los títulos infectivos se determinaron por ensayo de placa, mostrando una significativa disminución de los títulos virales a partir de las 8hs post-infección, llegando a reducirse un 80% a las 24hs. Para determinar si los microtúbulos son requeridos para el movimiento del vP desde su sitio de replicación hacia la membrana plasmática, las células fueron incubadas con nocodazol o taxol a las 6hs post-infección, tiempo en el que las proteínas virales ya han sido sintetizadas, y por un lapso de 18hs. El análisis mostró gran cantidad de partículas virales presente en el citoplasma y en la región perinuclear debido, probablemente, a la inhibición en el transporte de proteínas y/o los viriones hacia la membrana plasmática. Cuando el nocodazol (droga reversible) es removido del medio de cultivo, se observa que los microtúbulos adoptan la forma característica de una célula infectada en un estadio tardío, dando lugar a la progresión de la infección. Por inmunofluorescencia observamos aumento en la inmunomarcación de proteínas virales en el citoplasma, esto podría deberse a que al recuperarse los microtúbulos, las partículas virales pueden completar su ciclo normal y así brotar e infectar células vecinas. Para determinar la posible asociación de las proteínas del vP con los microtúbulos, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación de tubulina a partir de un lisado de células Vero infectadas. La proteína E2 coinmunoprecipita con tubulina, mientras que las proteínas E1 y C no están presentes. A su vez, por inmunofluorescencia observamos una fuerte colocalización entre los microtúbulos y las proteínas virales. Nuestros resultados sugieren una interacción entre la proteína E2 de la envoltura del vP con los microtúbulos, quienes participarían en el movimiento de ésta proteína hacia sus sitios de localización final para permitir la brotación de los viriones. El tratamiento de las células infectadas con nocodazol o taxol previene la progresión de la infección, sugiriendo que un citoesqueleto de microtúbulos intacto es esencial para que el vP replique, ensamble y brote de la célula. El tratamiento con nocodazol, después de la síntesis de las proteínas virales, inhibe el progreso de infección y la liberación del virus ya que al lavar la droga, se restablece la salida de los viriones. Estos resultados apoyan la idea de que los microtúbulos estarían involucrados en el transporte de las proteínas virales o los viriones hacia sus sitios de liberación final.