Ciclo replicativo de miembros del complejo de Encefalitis Equina Venezolana: la clave para esclarecer aspectos críticos de su patogénesis

PIRIS, FRANCO MARTIN; GHIETTO, LUCIA MARIA; GIL, PEDRO IGNACIO; CONTIGIANI, MARTA; PAGLINI MARÍA GABRIELA

Cordoba

Congreso; XLII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología (SAV); 2022

Sociedad Argentina de Virología

El complejo de Encefalitis Equina Venezolana (VEE) es uno de los serogrupos en los que se clasifican los Alphavirus del Nuevo Mundo. Son transmitidos por vectores hematófagos y causan brotes periódicos en América de Sur, en caballos y humanos. El objetivo general del trabajo fue caracterizar el ciclo de replicación del virus Pixuna (PIXV) y del virus Rio Negro (RNV) en células Vero clon 76 mediante diferentes técnicas. En primer lugar, se diseñó y optimizó un ensayo de rt-PCR en tiempo real (rt-qPCR) para la cuantificación de los genomas virales. En segundo lugar, se adaptó el RNV a las células Vero clon 76 mediante 10 pasajes ciegos. El último sobrenadante constituyó el stock viral que fue titulado por ensayo de placa (EP). Para describir el curso temporal de la infección, se infectaron células Vero con RNV o PIXV (MOI 0,1), se recolectaron los sobrenadantes y monocapas a diferentes horas postinfección (2, 4, 6, 8, 12 y 24 hpi) que fueron titulados por EP y rt-qPCR. Paralelamente, las células fueron procesadas para inmunofluorescencia (IF) y analizadas por microscopía con el fin de observar la progresión de la infección viral intracelular y los cambios en el citoesqueleto de actina. A partir de los resultados obtenidos, se observó que el intervalo de tiempo desde la infección hasta el comienzo de la fase estacionaria, tanto para el PIXV como para el RNV es de 24 horas, representando el tiempo requerido para completar la curva de crecimiento viral. Las primeras 4 hpi correspondieron a la fase eclipse, donde el virus ingresa y se produce el desnudamiento de los viriones. Desde las 4 a las 24 hpi, la infección progresó hacia una etapa de crecimiento rápido llamada fase exponencial, donde se cuantificó el máximo rendimiento viral. Mediante la técnica de IF, entre las 6 y 8 hpi se observan las primeras células infectadas (10 %) para ambos virus, donde se visualizan las proteínas virales en la región perinuclear, sitio en el cual éstas son sintetizadas y procesadas. A las 12 hpi, aumenta la inmunomarcación en la región perinuclear y las proteínas virales comienzan a distribuirse en gran parte del citoplasma, para finalmente, a las 24 hpi invadirlo por completo. En esta etapa el 100% de las células se encuentran infectadas. Además, las imágenes obtenidas demuestran que la infección con PIXV y RNV afecta drásticamente la morfología celular, observando un marcado efecto citopático. Esto se corresponde con una reorganización del citoesqueleto de actina, donde en células no infectadas se observan claramente las fibras de estrés, mientras que a las 12 hpi estas fibras desaparecen y se observa un cinturón de actina en la región subcortical. Este es el primer paso en el conocimiento de la biología celular de la infección del PIXV y el RNV en cultivos de células Vero, necesarios para poder desarrollar estrategias de prevención y tratamientos de enfermedades causadas por los alfavirus del Nuevo Mundo que presentan una creciente reemergencia a nivel mundial.