Internalización y trafico endocitico de miembros del Complejo de Encefalitis Equina Venezolana

GHIETTO, LUCIA; PEDRO IGNACIO GIL; OLMOS QUINTEROS, PALOMA; NEIRA, MELANIE; KUNDA, PATRICIA; CONTIGIANI MARTA; PAGLINI MARÍA GABRIELA

Córdoba

Congreso; IV REUNIÓN CONJUNTA DE SOCIEDADES DE BIOLOGÍA DE LA REPÚBLICA ARGENTINA; 2020

Desde fines del Siglo XX, en nuestro país se conoce la circulación de subtipos enzoóticos de complejo de Encefalitis Equina Venezolana (VEE), familia Togaviridae, género Alphavirus. Si bien, estos virus son de gran importancia medica-veterinaria, poco se conoce hasta el momento sobre los mecanismos de entrada y transporte citoplasmatico, es por ello que en este trabajo nos plantemos como objetivo obtener evidencias sobre la participación de la maquinaria endocítica en el proceso de internalización y de liberación del genoma de los virus Pixuna (PIXV) y Rio Negro (RNV) dentro del compartimiento citoplasmático, mediante la expresión de proteínas dominantes negativas y el uso de agentes lisosomotropos. Para ello, se utilizaron cultivos de células Vero Clon 76 que fueron transfectados con plásmidos para EPS 15 (proteína involucrada en el proceso de endocitosis dependiente de clatrina) en su forma wild type (WT) y dominante negativa (DN) e infectadas con PIXV o con RNV a MOI 10. A las 8 horas postinfección (hpi) fueron fijados, procesados para inmunofluorescencia (IFI) y analizados por microscopía. Por otro lado, cultivos de células Vero fueron preincubados durante 30 min con 15 mM de Glucosamina o 25 mM de NH4Cl a 4ºC e infectados con PIXV o RNV con MOI 0,1 y 10. Los sobrenadantes fueron recolectados a las 4, 8 y 24 hpi para su titulación por placas de lisis. Paralelamente, monocapas infectadas con MOI 10 y tratadas con las drogas fueron fijadas a las 8 hpi para determinar la presencia del virus por IFI. Se observó que la sobreexpresión de la forma DN de Eps15 provocó una disminución significativa en el porcentaje de infección en comparación con la forma WT, tanto en los cultivos infectados con PIXV como con RNV. Por otro lado, los cultivos tratados con los diferentes agentes lisosomotropos e infectados con el PIXV o con el RNV mostraron una disminución significativa en los títulos virales extra e intracelulares a las 8 y 24 hpi en comparación con aquellos cultivos que no fueron tratados. Es importante destacar que esta disminución fue más marcada en los cultivos infectados con el RNV. La cuantificación del porcentaje de células infectadas mediante IFI, en todas las condiciones experimentales implementadas, concuerda con los resultados obtenidos por ensayo de placa. Nuestros resultados proporcionan evidencias de la participación de clatrina en el proceso de endocitosis tanto del PIXV como del RNV, junto con la dependencia del pH endosomal, implicado en el desnudamiento del virus. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que dos alfavirus, miembros del complejo VEE utilizan la endocitosis mediada por receptores dependiente de clatrina y la vía endosomal para liberar su contenido al citoplasma y continuar con su ciclo replicativo.