La dinámica del citoesqueleto de actina afecta la replicación de Metapneumovirus humano.

RODRIGUEZ PAMELA; GIL PEDRO; CAMARA JORGE; CAMARA ALICIA; PAGLINI MARÍA GABRIELA

Congreso; XXXVIII Reunión Cientifica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2018

AAM

La dinámica del citoesqueleto de actina afecta la replicación de Metapneumovirus humano.Rodríguez, PE(1); Gil, PI(1); Cámara J.A(1); Cámara, A(1); Paglini, MG(1,2).1.Instituto de Virología ?Dr. J. M. Vanella?. FCM. UNC.2.Instituto de Investigación Medica Mercedes y Martín Ferreyra ? INIMEC-CONICET-UNCMetapneumovirus humano (MPVh) es un agente causante de infección respiratoria en todos los grupos etarios. Su aislamiento y cultivo in vitro es dificultoso y en consecuencia su ciclo de replicación es poco conocido. Se sabe que un citoesqueleto intacto es importante para la replicacion de ciertos virus. En este sentido, el tratamiento con Citochalasina D (CytD) en etapas tempranas del ciclo de replicación del virus Pixuna, favorece la producción viral, ya que afecta la dinámica de los microfilamentos de actina (MFls). Además, existen evidencias que algunos Pneumovirus utilizan el citoesqueleto para su replicación y morfogénesis. Por esto, se propuso describir el ciclo de replicación de MPVh (aislado de una muestra clínica de Córdoba) para luego investigar la posible participación del citoesqueleto de actina en su proceso de replicación.Para ello, mediante RT-qPCR se cuantificó el ARN viral de sobrenadantes de cultivo de monocapas de células Vero infectadas con MPVh y cosechados a distintos tiempos: 24, 48, 72 y 96 horas post infección (hpi).Para analizar la participación del citoesqueleto de actina, las monocapas fueron infectadas y tratadas con CytD [2,5uM] por 24hpi, luego se mantuvo con medio sin droga hasta las 72hpi. A las 24hpi el sobrenadante de cultivo fue cosechado para ser cuantificado por RT-qPCR y las monocapas celulares para ser procesadas por inmunofluorescencia con anticuerpos específicos para MPVh y faloidina para visualizar los MFls.La cuantificación del ARN viral de los sobrenadantes permitió describir el ciclo de replicación de MPVh, obteniendo la máxima producción viral a las 48hpi, registrándose una disminución progresiva hasta las 96hpi. De manera interesante el tratamiento con CytD provocó un aumento significativo en el porcentaje de células infectadas y en la intensidad de fluorescencia viral respecto al control no tratado, con la consiguiente disminución de producción viral en sobrenadantes. Este aumento a nivel celular se mantuvo hasta las 72hs, a pesar de retirar la droga. Nuestros resultados muestran que la fase exponencial de replicación viral culmina a las 48hs obteniendo la máxima producción y liberación de progenie, representando las primeras 24hs el inicio de los procesos de replicación. Por otro lado la disrupción de los MLFs con CytD, en las primeras 24hs del ciclo de MPVh, provocó un aumento de células infectadas y cantidad de proteína viral intracelular, en concordancia con los bajos niveles de progenie viral extracelular. Podemos concluir que la disrupción de los MLFs aumenta no solo la proporcion de celulas infectadas, sino también la acumulación de proteinas virales en el citoplasma y la disminución de la liberación de los viriones al espacio extracelular. Estos resultados sugieren que en las primeras 24hs del ciclo de MPVh, los MLFs participarían tanto en la entrada como en la salida de los viriones. Destacamos la importancia al describir por primera vez la biología de infección de MPVh aislado en Córdoba.