Identificación del primer aislamiento de metapneumovirus humano en células Vero a partir de muestra clínica obtenida en la ciudad de Córdoba

RODRIGUEZ PAMELA; GIL PEDRO; CAMARA JORGE; PAGLINI MARÍA GABRIELA; CAMARA ALICIA

BSAS

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología (CAV); 2017

Metapneumovirus humano (MPVh) fue aislado en el año 2001 por Van den Hoogen, sin embargo se sabe que el aislamiento en cultivo celular in vitro es dificultoso, ya que la adaptación del virus requiere entre 14-21 días para visualizar el efecto citopático (ECP). Ha sido descripto como formación de sincicios o como cambios en la morfología celular, tornándose pequeñas, redondas y refringentes. Se han identificado grupos genéticos A y B, que se dividen en subgrupos 1 y 2. En Argentina, se determinó en el 2006 la presencia de MPVh A1, A2 y B1, y que en 2009 y 2010 circularon A2 y B2. En Córdoba, nuestro laboratorio demostró la circulación del subtipo A2 en el 2011. El objetivo de este trabajo fue aislar e identificar el agente viral MPVh a partir de muestras clínicas en cultivos de línea continua de células. Para esto, se utilizó una adaptación del protocolo de infección de Van den Hoogen (2001). Las monocapas de células VERO, fueron cultivadas en DMEM (10% SFB, y 1% ATB) de crecimiento y en DMEM de infección (0,3% BSA y 0,0012 % tripsina). La muestra clínica utilizada (tomada en 2015) fue positiva para MPVh por inmunofluorescencia (IF). Para el aislamiento viral se realizaron 4 pasajes ciegos de 21 días cada uno, teniendo en cuenta la aparición de ECP como señal de infección viral, luego se confirmó por IF dirigida a la proteína F del virus. Por último se realizó una RT-PCR one-step para detectar ARN viral en los sobrenadantes de los cultivos a distintos días post-infección. Estos fueron enviados a secuenciar para comprobar su identidad. Por último se realizó el análisis filogenético de la región F y se construyó un árbol por Maximun Likelihood (PhyML), usando modelo TIM2+I+G, con parámetros sugeridos por JModelTest 3.7, bootstrap y 1000 pseudoreplicas. La muestra clínica inoculada, provocó un ECP caracterizado por el redondeamiento y la formación de ramilletes de células luego del 3er pasaje ciego, a los 14 días post-infección. La infección fue corroborada por IF, revelando la presencia de proteína viral dentro del citoplasma celular a partir del cuarto día post-infección. Se confirmó presencia de ARN viral en sobrenadantes por RT-PCR, su posterior secuenciación y confirmación de identidad y pertenencia de esta cepa autóctona al grupo A2, relacionándose de manera directa con la cepa aislada en 2001 por Van den Hoogen y otras identificadas en Buenos Aires. Se logró el primer aislamiento, el cultivo in vitro e identificación de MPVh a partir de muestra clínica de la Provincia de Córdoba. Se caracterizó un patrón morfológico específico del ECP provocado por la infección viral y la presencia del virus fue corroborado por IF y RT-PCR. Se pudo determinar que en el año 2015 circuló el subtipo A2 que según bibliografía se considera un linaje emergente en los últimos años y se ha detectado en mayor medida en niños con neumonía, los estudios al respecto asocian cuadros clínicos más severos en presencia del genotipo A.