Nuevos aspectos moleculares de la interacción de la glucoquinasa con su proteína regulatoria

FRANCINI F; BALTRUSCH S; TIEDGE M; LENZEN S

Mar del Plata

Congreso; 48th Reunión Anual SAIC (Sociedad Argentina Investigación Clínica).; 2003

Glucoquinasa (GQ) es el sensor de glucosa (G) en células ß pancreáticas y hepáticas. Se modula post-transcripcionalmente por interacción con la proteína regulatoria de GQ (GRP), responsable de su translocación intracelular. Mediante phage display library screenings identificamos una secuencia consenso asparagina-leucina de unión a la GRP. Objetivo: caracterizar los mecanismos moleculares involucrados en la interacción GQ-GRP. Materiales y Métodos: se empleó mutagénesis dirigida de aminoácidos específicos en GQ (Altered Sites II Mutagenesis System). Las interacciones moleculares GRP-GQ se caracterizaron por MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 2 y verificó por selección en placa y quimioluminiscencia cuantitativa (ß-galactosidasa). La actividad de GQ se midió por fotometría. Resultados: La secuencia de unión se localizó en 3 áreas de la GQ: Leu309/Asn313 (A), Asn350/Leu355 (B) y Leu58/Asn204 (C). A se ubica en una secuencia señal de exportación nuclear mientras C en el sitio catalítico. Doble mutación Leu58/Asn204 y simple Leu58 y Asn204 generó pérdida total de interacción con GRP, disminuyendo significativamente la actividad enzimática. Doble mutación Asn350/Leu355 y simple Leu355 mantuvo su interacción GK/GRP aunque disminuida en 50 % respecto a GQ salvaje. Interesantemente la doble mutación Leu309/Asn313 y la simple Asn313, aumentaron la actividad del gen reportero.Conclusion: Leu58/Asn204 en vecindad del bolsillo catalítico de GQ es esencial para su interacción con GRP. Leu309/Asn313 y Asn350/Leu355, localizados en la superficie del lóbulo C-terminal de GQ modifican la afinidad por GRP. Mutagénesis dirigida de estos residuos abre nuevas perspectivas para generar GQ con afinidades mayores y menores por la GRP, permitiendo modulación dirigida de la regulación al corto plazo del metabolismo de G en hígado.