EMPLEO DE DFBA PARA LA OPTIMIZACIÓN DEL CULTIVO DE ALTA DENSIDAD DE E. COLI BL21(DE3) EN SISTEMA BATCH ALIMENTADO

MARÍA TERESITA CASTAÑEDA; PAMELA KIKOT; MARIANO GRASSELLI; HERNÁN DE BATTISTA

San Rafael

Congreso; CONGRESO LATINOAMERICANO DE INGENIERÍA Y CIENCIAS APLICADAS; 2022

Universidad Nacional de Cuyo

El modelizado y la simulación de redes metabólicas son herramientas computacionales muy empleadas para innumerables aplicaciones, entre ellas el diseño de fábricas celulares, la optimización de la producción de metabolitos de interés y la predicción de los fenotipos expresados bajo ciertas condiciones de cultivos. Por su parte, la cepa E. coli BL21 (DE3) es una de las cepas recombinantes más utilizadas industrialmente. Se ha empleado para la sobreproducción de proteínas recombinantes, biocombustibles y biorrefinerías debido a varias características favorables, como un crecimiento rápido en medios mínimos, menor producción de acetato, mayor expresión de niveles de proteínas recombinantes y menor degradación de dichas proteínas durante la purificación. Debido a ello, es imperioso hallar métodos que permitan analizar el metabolismo y desarrollar estrategias para incrementar la productividad en sistema de cultivo de alta densidad celular. En este trabajo se evaluó el empleo del Análisis de Balance de Flujo dinámico (dFBA) como herramienta de simulación y optimización del crecimiento de E. coli BL21 (DE3) en cultivo batch alimentado. Para ello, se utilizó el modelo metabólico de escala genómica iHK1487, conformado por 1877 metabolitos, 2701 reacciones y 1488 genes. Para la optimización del crecimiento en batch alimentado se empleó dFBA implementado mediante DFAlab. Se consideraron cinéticas tipo Monod para la glucosa, O2 y acetato, y se definieron ladinámica del volumen, sustratos (glucosa, O2, amonio) y productos (biomasa, acetato) mediante ODEs. Finalmente, la técnica empleada utiliza un esquema de optimización lexicográfica para el cual se estableció el siguiente orden de objetivos: biomasa, glucosa, amonio, O2 y acetato. Por último, se contrastaron los resultados obtenidos por simulación con ensayos experimentales, cultivando la cepa en medio de cultivo mineral conteniendo glucosa 20 g/l (Riesenberg, 1991) en biorreactor tipo tanque agitado de 5L (BIOSTAT Aplus, Sartorius). Se llevó a cabo una primera etapa batch de 3L hasta finalización de la fuente de carbono y luego se comenzó a alimentar con un flujo constante de 0,45-0,50 mL/min de una solución de 300 g/L de glucosa. Durante el proceso se registraron parámetros en línea (pH, gaseado, agitación, oxígeno disuelto %, temperatura) y se midieron peso seco, densidad óptica a 600 nm y concentración de glucosa. El oxígeno disuelto se mantuvo por encima de 10% mediante control automático de la agitación o bien mediante la mezcla de aire con oxígeno puro. El pH se fijó alrededor de 6,5 mediante el agregado de HCl o NH3. Los resultados obtenidos pudieron demostrar la aptitud del modelo empleado y la técnica dFBA para predecir el fenotipo de E. coli BL21 (DE3) en sistemas dinámicos de cultivo (batch y batch alimentado). Se encontró una buena correlación entre los resultados obtenidos in silico y lo observado experimentalmente en el laboratorio. Estos resultados preliminares indican que tanto los modelos metabólicos como la técnica empleada tienen potencial como plataforma de optimización para la mejora de los procesos y la predicción del comportamiento microbiano, previo al ensayo experimental. En futuros estudios se extrapolará estas metodologías a otras cepas de interés industrial.