Sitios de interacción entre los segmentos transmembranales del receptor nicotínico: su participación en la activación del canal

J CORRADI,; M J DE ROSA,; G SPITZMAUL,; M COSTABEL,; CECILIA BEATRIZ BOUZAT

Carlos Paz

Congreso; XXXIX Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2005

Los canales iónicos activados por ligandos juegan un rol esencial en la transmisión sináptica. El receptor nicotínico (AChR), miembro de esta familia de canales, es uno de los componentes principales de la unión neuromuscular. En el músculo adulto es un heteropentámero de subunidades alfa2betaepsilondelta. La región transmembranal de cada subunidad está formada por cuatro segmentos (M1-M4). M2 forma las paredes del canal mientras que el rol funcional de los demás segmentos no se conoce todavía claramente. El modelo estructural recientemente reportado postula que existirían interacciones puntuales entre M1-M2 y M3-M2 de la subunidad alfa. Para determinar experimentalmente si dichos residuos están interactuando, y cómo dicha interacción contribuye al gatillado del canal, intercambiamos los aminoácidos de M1 ó M3 por el residuo correspondiente en M2 y viceversa (mutaciones simples) y combinamos ambas mutaciones (mutaciones dobles). Luego analizamos por patch-clamp la cinética de activación de las mutaciones simples y dobles, y realizamos un análisis termodinámico de dobles mutantes. Los resultados obtenidos para el par M1- M2 (F225L-L253F) muestran que estos residuos afectan la activación del canal, que sus contribuciones son dependientes y que son funcionalmente intercambiables. El análisis demostró una energía de acoplamiento de 1.4 kcal/mol, indicando interacción entre M1 y M2. El análisis de los potenciales sitios de contacto entre M2-M3 (L250I-I296L, L257I-I289L, V261A-V285A) demuestra interacciones mucho menos significativas. Sin embargo, la mayoría de las mutaciones en estos residuos afectan la cinética del AChR, revelando la importancia en el gatillado del canal. Finalmente se modeló la estructura del AChR salvaje y la de todos los mutantes, con el fin de correlacionar los datos electrofisiológicos con datos estructurales. El efecto más claro se observa en la mutación en L253F en M2, posición que interacciona con F225 de M1, la cual lleva a la presencia de dos residuos aromáticos. En esta mutación se observa una interacción de tipo "edge-to-face" haciendo más rígida la estructura y disminuyendo así la activación del canal, en concordancia con los resultados electrofisiológicos. En el resto de las mutaciones se estudió la combinación del efecto hidrofóbico con restricciones estereoquímicas originadas por el reemplazo de las cadenas laterales. El modelado apoya la importancia de los aminoácidos en la función del AChR. En conclusión, nuestro estudio revela la existencia de un acoplamiento funcional entre M1 y M2 de gran importancia en el gatillado del canal. Los sitios propuestos de interacción M2-M3 no parecen tener un rol tan significativo en el gatillado del canal.