Desarrollo y validación de un método magnético de aislamiento de vesículas extracelulares urinarias para aplicación en patologías renales a nivel clínico: estado de avance

JUAN M. MINOIA; VANESA TORBIDONI; M. VASQUEZ MANSILLA; R.D. ZYSLER; MARÍA LUCÍA ROSENBERG; PABLO AZURMENDI; ELIZABETH ODDO; RAINERI, MARIANA; ROXANA PERONI

Buenos Aires

Congreso; I Workshop Anual del Grupo Argentino de Vesículas Extracelulares; 2023

Facultad de Farmacia y Bioquímica - uba

Nuestro objetivo es desarrollar y validar una tecnología de separación y concentración de vesículas extracelulares (EVs) basada en su reconocimiento por parte de nanopartículas magnéticas funcionalizadas con un aptámero de ADN con capacidad de unión a la tetraspanina CD63. Resultados: Sintetizamos nanopartículas de Fe2O3 (NPMs) por coprecipitación a altas temperaturas en presencia de carboximetilcelulosa (CMC) para obtener grupos carboxilos, necesarios para la unión posterior al grupo NH2- del aptámero. Características de las NPM-CMCs obtenidas: 26,14 ± 3,10 nm (TEM); superparamagnéticas y redispersables (magnetización en función del campo); 59,66 emu/g (magnetización de saturación); presencia de pico característico de la unión Fe-O a 552 cm-1, de picos correspondientes a los grupos funcionales de la CMC y de grupos COOH (técnica de cambio de potencial Z en KNO3 10 mM a distintos pH); pérdida de carga negativa y consecuente aumento del diámetro hidrodinámico frente a concentraciones crecientes de dadores de grupo amino. Mediante inmunofluorescencia observamos que el aptámero CD63 (aptCD63), mas no uno de secuencia aleatoria (aptScr), reconoció las células de cáncer de mama MDA-MB-231 que expresan CD63 (1:1000; 16 h a 4ºC). Mediante un método de precipitación modificado diseñado por nuestro grupo, obtuvimos EVs urinarias de origen humano que fueron analizadas por TEM, por DLS y por citometría de flujo con anti-CD63. En todos los casos se observa la presencia de vesículas de morfología compatible con EVs de 30-140 nm de diámetro y con un 60% de positividad para CD63. A su vez, incubamos EVs con diluciones de aptámero por 16 h a 4ºC y observamos por citometría de flujo una población de EVs urinarias positiva para la marca con aptCD63 significativamente superior a la que aparece cuando las EVs son incubadas con aptSCr (1:100 y 1:1000). Conclusiones: Logramos funcionalizar las NPMs con grupos carboxilo con capacidad de unión al grupo amino del aptCD63, el cual a su vez, reconoció de manera selectiva y sensible su blanco en células y en EVs urinarios de 30 a 140 nm. Esperamos avanzar hacia la funcionalización de las NMP-CMCs con aptCD63 y evaluar su capacidad de aislamiento de EVs urinarias por el método magnético. Esta tecnología sería aplicable a otras matrices biológicas.