Identificación y caracterización de una novel fosfolipasa extracelular presente en aislamientos clínicos de Enterobacter aerogenes

FEDRIGO, G. V; CLEMENTÍN, A. L; CASTELLI, M. E.; GARCÍA VÉSCOVI, E.

Rosario

Congreso; Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2005

Sociedad de Biología de Rosario

Enterobacter es un género perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, cuyos integrantes son patógenos oportunistas, típicamente asociados a infecciones nosocomiales. presentando creciente incidencia en las unidades de cuidados intensivos. No obstante, se desconoce la identidad y mecanismo de acción de sus factores de patogenicidad. A partir de la biotipificación de una colección de cepas de E. aerogenes aisladas de muestras clínicas, se seleccionó una cepa uropatógena que presentó actividad lipasa extracelular en ensayos de detección en placa. Dicha actividad estaba ausente en cepas aisladas de flora entérica humana normal lo que sugirió su posible rol como factor de virulencia. Puesto de que la secuencia genómica de E. aerogenes no está disponible y con el objeto de identificar el factor en estudio, se llevaron a cabo simultáneamente la construcción de una biblioteca sub-genómica y un protocolo de mutagénesis al azar mediante conjugación bipartita utilizando un mini-transposón derivado del Tn5. A partir de la biblioteca se aisló un clon albergando un gen cuya secuencia reveló homología a genes que codifican para una fosfolipasa presente sólo en el genoma de cepas de los géneros Serratia, Yersinia, Xanthomonas, y Photorabdus. La caracterización de la actividad lipolítica de la exoenzima mediante zimograma, cromatografía en capa delgada y en medio líquido mostró que corresponde a una actividad fosfolipasa de tipo A1. Paralelamente, del rastreo de la mutagénesis se recuperaron 22 mutantes fenotípicamente nulas para la expresión de actividad lipasa, de las cuales se seleccionaron seis cepas. Sorprendentemente, el análisis de las secuencias adyacentes al transposón reveló que todas las inserciones analizadas se localizaron en genes con homología a los genes wecD, wecE, wecF, y waaF de enterobacterias. Los genes del locus wec están involucrados en la via biosíntetica del glicolípido de membrana denominado antígeno común de enterobacterias (ECA), de función aún desconocida. waaF está implicado en la biosíntesis del lipopolisacárido. Estas mutantes no están afectadas en la expresión de otras exoproteínas (ej. hemolisina), lo que sugiere que los productos de los genes wec y waa participarían en el mecanismo de expresión, ensamblaje o secreción de la lipasa