Modulación por proteína quinasas activadas por mitógeno (MAPKs) del estrés oxidativo (EO) y la alteración de la función secretora hepatocanalicular inducida por tert-butilhidroperóxido (tBOOH)

TOLEDO F.D.; BASIGLIO C.L.; BOAGLIO A.C.; BAROSSO I.R.; ZUCCHETTI A.E.; SÁNCHEZ POZZI E.J.; ROMA M.G.

Rosario

Congreso; Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Fisiología (SAFIS) 2012; 2012

Sociedad Argentina de Fisiología (SAFIS)

En estudios previos en duplas aisladas de hepatocitos de rata, demostramos que el tert-butilhidroperóxido (tBOOH), un agente que provoca EO vía formación de poros de transición de permeabilidad mitocondrial, induce alteraciones en la función secretora hepatocanalicular vía internalización endocítica de transportadores canaliculares, y que las MAPKs del tipo ERK 1/2, JNK 1/2 y p38MAPK están involucradas en dicho efecto. En este trabajo, indagamos en el mecanismo de injuria oxidativa mediado por MAPKs, estudiando la participación de las misma en la generación de EO inducido por tBOOH. La mediación de MAPKs en la alteración secretora hepatobiliar fue además confirmada en el modelo de hígado aislado y perfundido de rata (HAPR), el cual conserva la integridad fisiológica epitelial. Para estudiar la influencia de las MAPKs en la generación de EO inducido por tBOOH, se trataron hepatocitos de rata en cultivo primario con tBOOH (100 µM) durante 15 min, preincubados (o no) durante 15 min con inhibidores específicos de MAPKs del tipo ERK 1/2 (PD098059 ?PD?, 5mM), JNK 1/2 (SP600125 ?SP?, 1µM) o p38MAPK (SB203580 ?SB?, 1µM). El EO se evaluó midiendo a) la lipoperoxidación de membranas (LPO), mediante la formación de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico y b) la formación intracelular de especies reactivas del oxígeno (ROS), utilizando del fluoróforo redox 2´,7´-diclorofluoresceína. Todos los inhibidores de MAPKs previnieron significativamente la LPO y la formación de ROS inducidas por tBOOH. En el modelo de HAPR, la perfusión con tBOOH (75 µM, 10 min) redujo significativamente el flujo biliar (-73±13%, p<0.001), mientras que la perfusión previa con los diferentes inhibidores de MAPKs previno significativamente esta caída: PD (5 µM; +55±18%; p<0,001), SP (1 µM; +47±23%; p<0,001) y SB (250 nM; +45±16%; p<0,001). Se evaluó además la mediación de MAPKs en el efecto deletéreo de tBOOH sobre la función secretora de los transporadores canaliculares Bsep (bomba exportadora de sales biliares) y Mrp2 (proteína asociada a la resistencia a multidrogas 2), responsables de la formación de bilis dependiente e independiente de sales biliares. Para ello, se monitoreó la excreción biliar del sustrato de Bsep taurocolato (TC) y del sustrato de Mrp2 dinitrofenilglutation (DNP-SG), generado dentro del hepatocito a partir de su precursor 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB), administrado exógenamente. La perfusión con tBOOH (75 µM, 10 min) redujo significativamente la excreción de TC (-64±14%, p<0.001) y de DNP-SG (-60±9%, p<0.001), mientras que la pre-perfusión con los inhibidores de MAPKs PD (5 µM), SP (1 µM) y SB (250 nM) logró prevenir esta disminución, independiente del sustrato analizado. Concluimos que las MAPKs de tipo p38MAPK, ERK 1/2 y JNK 1/2 participan parcialmente en las alteraciones de la función secretora biliar inducidas por tBOOH, previniendo la generación de ROS y la consecuente inhibición de la función de transporte responsable de la generación de bilis.