Mecanismo de endocitosis de transportadores canaliculares en la colestasis por estradiol 17ß-D-glucurónido: Estudios en duplas aisladas de hepatocitos de rata

MISZCZUK G.S.; BOAGLIO A.C.; BAROSSO I.R.; LAROCCA M.C.; SÁNCHEZ POZZI E.J.; ROMA M.G.

Buenos Aires

Congreso; XVIII Congreso Argentino de Hepatología; 2015

Asociación Argentina para el Estudio de las Enfermedades Hepáticas (AAEEH)

Entre las colestasisde tipo adquirida, se destaca la colestasis del embarazo, habiéndose implicado en su patogénesis al metabolito estrogénico endógeno estradiol 17ß-D-glucurónido(E17G). Previamente, demostramosque los transportadores canaliculares Bsep y Mrp2, esenciales para la formaciónde bilis, sufren internalización endocítica en diferentes modelos de colestasis, siendo este fenómeno responsable de la falla secretora biliar en lacolestasis inducida por E17G. Se desconoce el mecanismo por el cual E17G induce dicha endocitosis, siendo su elucidación el objetivo de este trabajo. Métodos: Se obtuvieron DAHR mediante doble perfusión de hígados de rata con colagenasa, se enriquecieron por elutriación, se cultivaron 4,5 hs. en placas con colágeno (37ºC, 2x104 cél/mL) en medio L15 y, finalmente, se expusieron a E17G 200 µM durante 20 min, o a su vehículo(DMSO; grupo control). Se realizaron pre-tratamientos de 15 min para inhibir la endocitosis dependiente de clatrina con i) monodansil-cadaverina (MDC) 100 µM o ii) depleción de K+ (-K+), así como la endocitosis dependiente de caveolina con filipina (F) 1µg/mL. La actividad de Bsep y Mrp2 se evaluó mediante el análisis de imágenes obtenidas por microscopía de fluorescencia luego de incubar las DAHR durante 15 min con 0,3 µM CGamF (sustrato fluorescente de Bsep) o con 2,5 µM CMFDA (precursor de GS-MF, sustrato fluorescente de Mrp2).Así, se determinó el % de DAHR (> 200) que exhibieron acumulación vacuolar canalicular (AVc) de los sustratos fluorescentes. Por inmunofluorescencia seguida de microscopía confocal, se evaluó el efecto de MDCy F sobre la localización intracelular de Bsep y Mrp2, así como el efecto de E17G en la colocalización de Mrp2 con estructuras involucradas en la endocitosis dependiente de clatrina, como clatrina y AP2. Resultados: El E17G disminuyó la AVc de CGamF (45,8±7,5%) y GS-MF (48,7±8,6%) respecto del control (100%), p<0,05. Dicho fenómeno fue prevenido con inhibidores de la endocitosis dependiente de clatrina (MDC+E17G: 88,8±13,4%y 101,7±7,4%, -K++E17G: 81,9±12,3% y 90,0±16,5%). En cambio, F no afectó la disminución de la AVc de CGamFy GS-MF inducida por E17G (F+E17G: 48,6%±10,7% y 40,9%±11,7%,respectivamente). El pretratamiento con MDC inhibió completamente la endocitosis de Mrp2 y Bsep inducida por E17G. E17G incrementó significativamente el porcentaje de Mrp2 colocalizando con AP2 (Control: 15±1%y E17G: 19±1%, p<0,05) y clatrina (Control: 20±4% y E17G: 35±3%, p<0,05).Conclusión: La endocitosisde Mrp2 y Bsep inducida por E17G es clatrina dependiente, dado que MDC previene su internalización, y tanto este inhibidor como la depleción de K+ previnieronla falla secretora biliar asociada a la internalización de estos transportadores. Más aún, E17G incrementó la colocalización de Mrp2 con clatrina y la proteína adaptadora AP2, indicando la presencia de este transportador canalicular en vesículas pericanaliculares originadas por endocitosis dependiente de clatrina.