Concentraciones fisiológicas de bilirrubina no conjugada previenen la colestasis inducida por estrés oxidativo (EO) en el hígado aislado y perfundido de rata (HAPR)

BASIGLIO C.L.; TOLEDO F.D.; ARRIAGA S.M.; OCHOA J.E.; SÁNCHEZ POZZI E.J.; MOTTINO A.D.; ROMA M.G.

Buenos Aires

Congreso; XVII Congreso Argentino de Hepatología; 2013

Asociación Argentina para el Estudio de las Enfermedades Hepáticas (AAEEH)

Introducción: En estudios previos en duplas de hepatocitos aislados, demostramos que el EO provoca falla secretora por internalización endocítica de transportadores canaliculares responsables de la formación de bilis (Bsep y Mrp2), por alteración de la integridad del citoesqueleto de actina. La bilirrubina es considerada actualmente un importante antioxidante endógeno, y sus niveles aumentan en colestasis. Si la bilirrubina contribuye a limitar la colestasis por EO es incierto, aunque resultados previos “in vitro” de nuestro grupo así lo sugieren. Objetivo: Confirmar la capacidad de la bilirrubina no conjugada (BNC) para limitar las alteraciones de la función secretora biliar inducida por el pro-oxidante modelo tert-butilhidroperóxido (t-BOOH) en el HAPR, un modelo que mantiene la integridad funcional y estructural del órgano intacto. Métodos: En HAPR, se evaluaron los cambios temporales en: a) la relación entre glutatión oxidado (GSSG) y total (oxidado+reducido, GSHt) en bilis, un parámetro que refleja el EO intracelular; b) el flujo biliar; c) la excreción biliar del sustrato de Bsep, taurocolato (TC), adicionado al perfusato; d) la excreción biliar del sustrato de Mrp2, dinitrofenil glutatión (GS-DNP), previa adición al perfusato de su precursor cloro-dinitrobenceno (CDNB). Al finalizar la perfusión, se tomaron muestras de tejido hepático para evaluar la localización de los transportadores canaliculares y del citoesqueleto de actina, por doble tinción con anticuerpos primarios específicos y secundarios fluorescentes (para Bsep y Mrp2) y faloidina-Alexa Fluor 568 (para actina). Resultados: t-BOOH (75 µM, 10 min) indujo un aumento agudo y transitorio en la relación GSSG/GSHt en bilis (+167±28%), y la pre-perfusión con BNC previno totalmente este fenómeno (p<0,05; n=4). El flujo biliar cayó abruptamente, llegando a un mínimo 20 min después de perfundido t-BOOH (-71±3%), y la BNC previno completamente esta disminución (p<0,05; n=5). t-BOOH indujo una disminución en la excreción biliar de TC (-46±12%) y de GS-DNP (-130±37%), y BNC previno ambas alteraciones (p<0,05; n=4). Mediante microscopía confocal, se observó que t-BOOH produjo desorganización del citoesqueleto de actina, así como internalización endocítica de Bsep y Mrp2. La pre-perfusión con BNC previno casi completamente estas alteraciones. Conclusión: La acción antioxidante de BNC, incluso a concentraciones fisiológicas, contrarresta la alteración de la función secretora biliar producida por EO, manteniendo la integridad del citoesqueleto de actina y, consecuentemente, la localización de los transportadores canaliculares. Esto podría contribuir a limitar la progresión de hepatopatías colestásicas, las cales cursan con altos niveles de EO, y a explicar por qué otras hepatopatías con altos niveles de EO cursan sin alteraciones colestásicas evidentes, por ej., esteatohepatitis alcohólica/no-alcohólica, hepatitis virales, etc.