Cultivos primarios de hepatocitos en “sándwich de colágeno” (CPHS): Un nuevo modelo “in vitro” para el estudio de alteraciones funcionales colestásicas

MISZCZUK G.S.; BAROSSO I.R.; ZUCCHETTI A.E.; PELLEGRINO J.M.; SÁNCHEZ POZZI E.J.; ROMA M.G.; CROCENZI F.A.

Buenos Aires

Congreso; XVII Congreso Argentino de Hepatología; 2013

Asociación Argentina para el Estudio de las Enfermedades Hepáticas (AAEEH)

Introducción:Para evaluarin vitro las alteraciones funcionales de transportadores en patologías colestásicas, se requieren modelos celulares polarizados, tales como las duplas aisladas de hepatocitos de rata. Sin embargo, los modelos existentes tienen bajo rendimiento celular y corta vida útil (6-7 hs), no siendo factible su uso cuando se requieren cantidades apreciables de proteína (por ej.,WesternBlots) o cuando se quieremodular la expresión génica (por ej., “knockdown” con ARN de interferencia). Se demostró que los CPHS forman una red de pseudocanalículos con capacidad secretora biliar y conservan durante varias semanas sucapacidad biosintética, funcional y metabólica, por lo que serían útiles para tal fin.Objetivos: Evaluar la utilidad de los CPHS para estudiar alteraciones funcionales en los transportadorescanalicularesen colestasis experimental por exposición al estradiol 17β-d-glucurónido (E217G), metabolito colestásico del estradiol.Materiales y Métodos:Se aislaron hepatocitos por perfusión con colagenasa de hígados de ratas Wistar hembra. En placas de cultivo de 6 pocillos recubiertas con 100 µl de colágeno gelificado, se sembraron 3 ml por pocillo de una suspensión de 4,5 x105 células/ml en medio de cultivo DMEM adicionado con suero fetal bovino, antibióticos, dexametasona, insulina y glucosa. A las 24 hs, se agregó la segunda capa de colágeno, renovándose el medio diariamente. Al tercer día de cultivo, se evaluó el efecto de E217Gsobre la actividad del transportador canalicular Mrp2. Para ello, se incubaron los CPHS durante 1 h con E217G (25-200 µM) o dimetilsulfóxido (controles), y se montaron las placas sobre una platina termostatizada en un microscopio de fluorescencia invertido. Luego, se agregó cloro-metilfluoresceína-diacetato (2,5µM), precursor metabólico del sustrato fluorescente de Mrp2 glutatión-metilfluoresceína, tomándose fotografías con una cámara digital a intervalos de 1 min durante 10 min. Utilizando el software ImageJ (NIH, EEUU), se seleccionaron entre 70 y100 pseudocanalículos, midiéndose la intensidad promedio de fluorescencia en ellos, y graficándosela misma vs. tiempo; la curva se ajustó mediante regresión lineal, considerándose la pendiente obtenida como una medida de la “velocidad inicial de transporte” (VIT) de Mrp2.Resultados y Conclusiones:E217G,a partir de 50 µM disminuyó significativamente, y con tendencia a depender de la concentración,la VIT de Mrp2 (Control: 20,5±1,3, E217G(25): 20,7±0,3, E217G(50): 13,7±2,4*, E217G(100): 11,6±2,1*; E217G(200): 11,4±1,4*; *p<0,05vs. control, n=7-12). Estos resultados sugieren que los CPHS son un modelo in vitro útil para el estudio de la biología celular de la colestasis por E217G y, por extensión, de otras patologías colestásicas. La factibilidad de obtener CPHS a partir de muestras de tejido hepático humano suma una ventaja adicional, al permitir la evaluación de mecanismos fisiopatológicos y posibles terapéuticas en patologías colestásicas humanas.