INVESTIGADORES
ROMA Marcelo Gabriel
congresos y reuniones científicas
Título:
La vía de calcio/calmodulina/quinasa dependiente de calcio-calmodulina II participa en las alteraciones colestásicas inducidas por estradiol 17-ß-D glucurónido en duplas aisladas de hepatocitos de rata (DAHR): rol de los canales de calcio
Autor/es:
ZUCCHETTI A.E.; MISZCZUK G.S.; BAROSSO I.R.; TOLEDO F.D.; ROMA M.G.; CROCENZI F.A.; SÁNCHEZ POZZI E.J.
Lugar:
Buenos Aires
Reunión:
Congreso; XVII Congreso Argentino de Hepatología; 2013
Institución organizadora:
Asociación Argentina para el Estudio de las Enfermedades Hepáticas (AAEEH)
Resumen:
Estradiol 17-ß-d
glucurónido (E), induce colestasis debido a que estimula internalización
endocítica de transportadores canaliculares tales como la bomba exportadora de
sales biliares (Bsep) y el transportador multiespecífico de aniones orgánicos
(Mrp2). La activación de diferentes vías de señalización tales como PKC, PI3K,
MAPKs y el receptor de estrógenos α han sido asociadas a esta alteración.
Calmodulina interactúa con este receptor y potencia su activación.
Concordantemente observamos que los efectos colestásicos de E requieren
aumentos en los nivele de calcio intracelular y activación de la quinasa
dependiente de calcio-calmodulina II (CamKII).
Por lo tanto, evaluamos el rol de canales de
calcio de diferente localización celular [membrana plasmática (MP) o retículo
endoplasmático (RE)] en las alteraciones inducidas por E.
La actividad de transportadores canaliculares se evaluó en un modelo de
duplas aisladas de hepatocito de rata (DAHR): DAHR se pre-incubaron 15min con
distintos inhibidores de canales de Ca2+ y de la vía estudiada:
Verapamilo, Nifedipina (V, 10µM o N, 0,3nM, bloqueantes de canales tipo L de
MP), Dantroleno (D, 1µM, inhibidor del receptor de rianoidina en RE),
2-Aminoetil difenilborinato (2-Am, 4µM, Inhibidor del receptor de
inositol-3-fosfato en RE), Trifluoroperazina (T, 10µM, inhibidor de calmodulina),
W7 (100µM, inhibidor de calmodulina) y KN62 (KN, 1µM, inhibidor de CamKII).
Luego se incubaron 20 min con E (100µM). Finalmente DAHR se expusieron a
colil-glicil-amido-fluoresceína (sustrato de Bsep, CGamF 0,3µM) o CMFDA (2,5µM,
intracelularmente convertido en glutatión-metilfluoresceína, GMF sustrato de
Mrp2). Las DAHR acumulando fluorescencia en sus vacuolas canaliculares se
contaron en microscopio de fluorescencia determinándose el porcentaje de las
mismas (%AvC).
La activación de CaMKII se evaluó en el modelo de hepatocitos aislados
cultivados en una doble capa de colágeno en configuración sándwich (HRCS): HRCS
cultivados por 5 días se expusieron a E (200µM) por 20min en presencia o
ausencia de los inhibidores antes mencionados. Se realizaron western blots de
las muestras usando anticuerpos contra la forma fosforilada y total de CaMKII.
Los resultados fueron expresados como media±SD.
Control
E
E+V
E+N
E+DN
E+AM
E+TFP
E+W7
E+KN
%AvC CGamF
100±0
50±2a
77±3b
76±7b
73±4b
79±3b
86±5b
87±6b
74±3b
%AvC GMF
100±0
55±3a
79±6b
75±1b
76±4b
73±2b
89±3b
87±5b
82±3b
Fosfo CamKII/CamKIItotal
(unidades arbitrarias)
100±0
173±9a
105±15c
98±7c
195±24a
106±3c
107±12c
117±16c
109±5c
a diferente de Control. b diferente de Control y E. c
diferente de E (p<0,05, n=3)
Conclusiones: las
alteraciones inducidas por E requieren la activación de CamKII. Esta activación
se daría a través de diferentes canales de Calcio como los tipo L de la MP o el
del receptor de IP3 en el RE. El receptor de rianodina, que participa en las
alteraciones inducidas por E, no activaría CamKII.