Modulación de la actividad de una proteína integral de membrana por fosfolípidos.

MARTÍN DODES TRAIAN; VALERIA LEVI; F. LUIS GONZÁLEZ FLECHA

Buenos Aires

Congreso; XL Reunion Anual de la Sociedad Argentina de Biofisica; 2011

Sociedad Argentina de Biofisica

Las interacciones lípido-proteína juegan un papel importante en elmantenimiento de la estructura y regulación de la actividad biológica de las proteínas integrales de membrana. Sin embargo los mecanismosmoleculares que vinculan estas interacciones con su actividad biológicatodavía no han sido dilucidados. En este trabajo exploramos la modulación por fosfolípidos de la actividad enzimática de las proteínas integrales de membrana, utilizando como modelo la bomba de calcio de la membrana plasmática (PMCA) reconstituida en micelas mixtas de detergente (C12E10) y dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC). La proteína unida a una columna de afinidad se purificó mediante el lavado exhaustivo con C12E10, y se reconstituyó en micelas de detergente. En estas condiciones la enzima evidenció actividad catalítica, aunque ésta fue baja (2.3 ± 0.4 mol Pi mg prot-1 min-1). El posterior agregado de DPPC produjo un incremento reversible en la actividad enzimática hasta alcanzar un valor máximo de 13 ± 1 mol Pi mg prot-1 min-1. La activación de PMCA por DPPC está asociada a un pequeño cambio estructural en las regiones hidrofóbicas que se evidencia mediante el aumento de la fluorescencia de la sonda ANS y una mayor transferencia de energía (FRET) desde los triptofanos de la PMCA hacia la sonda. Por otra parte, el intercambio DPPC-C12E10 que ocurre sobre el dominio transmembrana de PMCA fue evaluado por un ensayo de FRET utilizando una fosfatidilcolina marcada con pireno evidenciando una afinidad ligeramente mayor para DPPC (Kex = 1.4 ± 0.4). Los resultados obtenidos se pudieron explicar en términos de un modelo queincluye dos etapas. En una primera etapa la proteína selecciona, a través de diferencias de afinidad relativa, los fosfolípidos que recubren el dominio transmembrana. En la segunda etapa, se produce la transducción cooperativa entre la unión de los fosfolípidos y la actividad enzimática, mediada por el cambio conformacional que ocurre inicialmente en el dominio transmembrana y se propaga hacia el dominio catalítico.