Estabilidad estructural del dominio catalítico de CopA, un transportador termofílico de Cu+

ERNESTO A. ROMAN; LUIS M. BREDESTON; JOSÉ M ARGUELLO; F. LUIS GONZÁLEZ FLECHA

Buenos Aires

Congreso; XL Reunion Anual de la Sociedad Argentina de Biofisica; 2011

Sociedad Argentina de Biofisica

En un estudio previo (1) demostramos que la proteína termofílica ymultidominio de membrana de Archaeglobus fulgidus CopA, se despliegareversiblemente en presencia de cloruro de guanidinio (GnHCl), de acuerdo a un modelo de dos estados. Dado que CopA está compuesta por varios dominios solubles y de membrana, que tienen diferentes propiedades fisicoquímicas, surgen las siguientes preguntas: Un modelo de dos estados ¿es adecuado para describir el desplegamiento de CopA?, ¿Donde está codificada la termofilicidad en esta proteína? En este trabajo, el dominio catalítico de CopA (CopADC) fue aislado y desplegado con el objetivo de entender su contribución a la estabilidad general de la proteína. Nuestros resultados muestran que CopADC se despliega reversiblemente en presencia de GndHCl, con valores de ∆G, m, Cm y ∆Cp que son muy diferentes de los correspondientes a CopA. La desnaturalización de CopADC por temperatura también fue reversible y los valores de Tm fueron alrededor de 67oC en ausencia de ligandos, y alrededor de 70 oC en presencia de Mg2+/ATP. Ambos procesos fueron bien descriptos por un modelo de dos estados, sin embargo un intermediario de desplegamiento con GndHCl fue detectado por fluorescencia de ANS. Para un estudio mas detallado del desplegamiento de CopACD se prepararon dos mutantes de cisteína única en los subdominios de unión al nucleótido (A520C) y de fosforilación (A660C). Los dos dominios catalíticos se aislaron y marcaron con DTNB y los cambios en la distancia TNB-Trp producidos por el desplegado con GndHCl se evaluaron por FRET. Los resultados preliminares indican que no hay mayores diferencias en el desplegamiento de los subdominios. En resumen, los resultados obtenidos muestran que CopACD conserva la termofilicidad y la termoestabilidad de CopA, pero se despliega de una manera más compleja. En conclusión el comportamiento aparente de dos estados previamente descripto para CopA probablemente sea el resultado de la combinación de múltiples intermediarios de plegado no detectados.