INVESTIGADORES
SANTA COLOMA Tomas Antonio
congresos y reuniones científicas
Título:
Selección de aptámeros de ADN específicos para IL-1 beta humana recombinante.
Autor/es:
SANTA COLOMA TA; ASENSIO, CRISTIAN
Lugar:
Mar del Plata
Reunión:
Congreso; LVIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica, Mar del Plata, Noviembre 20-23 de 2013.; 2013
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Medicina Clínica
Resumen:
La IL-1β es una citoquina involucrada en numerosas patologías.
Existen anticuerpos monoclonales para detectarla o
inactivarla, pero no existen aptámeros de ADN. A partir de una
librería de ADN de cadena simple con 50 bases aleatorias centrales,
se hicieron varias rondas de selección contra IL-1β humana
recombinante como blanco. La IL-1β fue adherida a membranas
de nitrocelulosa, luego bloqueadas con BSA. En cada ronda los
aptámeros unidos a la IL-1β se eluyeron por calor y se amplificaron
por PCR. La cantidad de IL-1β se disminuyó a partir de la tercera
ronda de 100 a 25 ng. A partir de la cuarta ronda de selección la
señal obtenida por PCR fue mucho más alta que la señal de fondo
proveniente de la BSA utilizada en el bloqueado o que la señal
de un péptido control. Se han implementado nuevas estrategias
para hacer las distintas rondas de selección comparables entre
si y cuantitativas: el uso de proteínas y péptidos estándares que
unen ADN no-específicamente y el uso de cuadrículas diseñadas
en computadora e impresas en nitrocelulosa para pegar en
ellas proteínas o péptidos en forma ordenada y separada. Los
aptámeros se seleccionaron mediante una presión de selección
por afinidad y por especificidad. La especificidad se obtuvo mediante
la resta de los aptámeros amplificados por unión a BSA
depositada en nitrocelulosa (en todas las rondas de selección) y
también mediante la resta con lisados de líneas celulares humanas
y de S. cerevisiae transferidos a nitrocelulosa (Western Blots).
La unión de los aptámeros se monitoreó y cuantificó mediante
PCR/qPCR de los eluidos. Para la detección de los aptámeros
unidos al blanco en la nitrocelulosa, en Westerns o cuadrículas,
se utilizó la biotinilación en el extremo 5´ y el revelado mediante
estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina, HRP o CY3. Se
espera que estos aptámeros puedan servir para detectar IL-1β y
para bloquear la unión a sus receptores. Subsidios PIP 2009-2011,
2012-2014/ PICT 2012, 1278.