¿Qué pasó con el ARN? Importancia del clonado de células seleccionadas con plásmidos que expresan ARN de interferencia

VALDIVIESO ANGEL GABRIEL; MASSIP COPIZ MARÍA MACARENA; TAMINELLI GUILLERMO LUIS; CLAUZURE, MARIÁNGELES; SANCHEZ FRANCISCO; SCHULMAN GUSTAVO; TEIBER MARÍA LUZ; SANTA COLOMA TOMAS A.

Mar del Plata

Congreso; LVI Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica; 2011

Sociedad Argentina de Investigación Clínica

El uso de ARN de interferencia (ARNi) en el “knock-down” de proteínas es una herramienta muy valiosa, aunque algunas metodologías resultan costosas y poco prácticas cuando se experimenta con grandes cantidades de células (por ej.: el uso de oligonucleótidos de ARNi sintético). Una alternativa es el uso de plásmidos que expresan ARNi (“shot hairpin-RNAi”, sh-RNAi) con resistencia a antibióticos. Anteriormente, comenzamos a desarrollar un modelo celular de fibrosis quística (FQ) en células de cáncer de colon humano (Caco-2) usando sh-RNAi contra el CFTR para confirmar resultados obtenidos en otros modelos celulares, entre ellos, la reducción de la actividad del complejo I mitocondrial (CIm) en FQ. Se usaron cuatro sh-RNAi dirigidos contra diferentes regiones del CFTR y un plásmido control. Las transfecciones transientes mostraron efecto sobre la actividad del CIm aunque los resultados fueron difíciles de reproducir. Por esta razón, usamos la resistencia a puromicina de los plásmidos durante varios pasajes, para generar líneas celulares estables de cada sh-RNAi. Aunque tres de estas líneas con shRNAi mostraron una reducción significativa de la expresión del CFTR con respecto al control, las células fueron perdiendo paulatinamente la inhibición. Finalmente, clonamos las células seleccionadas mediante dilución al límite y seleccionamos los clones con menor expresión del CFTR respecto al control (células transfectadas con el plásmido control) por "dot-blot" con un anticuerpo monoclonal contra el CFTR. El próximo paso será medir la expresión del ARNm del CFTR por qRT-PCR y la actividad del CIm. El clonado de las células transfectadas con sh-RNAi podría prevenir la heterogeneidad de células con diferentes grados de interferencia y la disminución de la inhibición con los sucesivos pasajes. Agradecimientos: Subsidios del CONICET (PIP 2009-2011), ANPCYT (PICT-2007, 0628) y UCA. Becas CONICET (AGV, MMMC y GS), ANPCYT (MC), y UCA (GLT, FS, MLT).