? Desarrollo de una plataforma tecnológica de inmuno-pcr (ipcr) apta para la determinación de hormonas de interés clínico

ABUD J.; SANTAMARIA C; RAMOS G; MUÑOZ-DE-TORO M; LUQUE E; RODRÍGUEZ H

Congreso; LVIII REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL; 2013

Mediante la utilización de sondas de ADN reportera, la IPCR combina la versatilidad del ELISA con la PCR como sistema de amplificación de la señal. En consecuencia, el límite de detecci ón (LD) de la IPCR es entre 100-10.000 veces mayor que el de un ELISA homólogo por el uso de la PCR como un sistema de amplificación de señal. El objetivo general consiste en el desarrollo de sistemas diagnósticos de interés clínico basados en ensayos de IPCR. Para optimizar esta plataforma tecnológica, en una primer etapa diseñamos un ensayo de IPCR para la proteína glutatión- S-transferasa (GST) de Schistosoma japonicum. Para ello, se obtuvieron 21 líneas de hibridomas productores de anticuerpos anti-GST, tres de las cuales fueron seleccionadas para el proceso de clonado. Se amplificaron diferentes clones en cultivos in vitro a escala de laboratorio y se obtuvieron anticuerpos monoclonales (mAbs) anti-GST purificados por cromatografía de afinidad a proteína G. Para la obtención de sondas de ADN biotiniladas se llevaron a cabo reacciones de PCR de punto final con el plásmido pBluescript como molde, utilizando oligonucleótidos biotinilados en el extremo 5´. Se determinó un LD para los ensayos de IPCR directa y sandwich, de 1x10-3 µg/ml y 1x10-4 µg/ml respectivamente, representando una mejora en el LD de 1000 veces entre el ELISA directo y la IPCR sandwich. En una segunda etapa, nuestro objetivo particular es la detección cuantitativa de la hormona h- TSH en suero humano basado en ELISA e IPCR. Para ello, se seleccionaron 10 líneas productoras de mAbs anti-hTSH, realizándose la selección clonal de 4 de estas líneas por dilución límite. Se purificaron 8 mAbs específicos para las distintas subunidades de h-TSH, los que luego se evaluaron en ensayos de ELISA de captura o sandwich logrando la detección de la hormona en concentraciones séricas (0,5 ? 50 μUI/ml). Actualmente, estamos abocados a la optimización de las condiciones experimentales de una IPCR apta para la detección de hTSH.