Síntesis de 1-Alquilbenzodiazepinones como Precursores de Sondas para Monitorear la Dinámica de Biomembranas

ANAHÍ DEL V. TURINA, ELIZABETH L. MOYANO, GLORIA I. YRANZO, MARÍA A. PERILLO

San Luis, Argentina

Congreso; XXVI Congreso Argentino de Química; 2006

AQA

SÍNTESIS DE 1-ALQUILBENZODIAZEPINONES COMO PRECURSORES DE SONDAS PARA MONITOREAR LA DINÁMICA DE BIOMEMBRANAS     Anahí del V. Turinaa*, Elizabeth L. Moyanob, Gloria I. Yranzob, María A. Perilloa   a-   Cátedra de Biofísica-Química, Departamento de Química, Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, UNC, b-INFIQC-Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Químicas, UNC.     Introducción           Las benzodiazepinas son drogas ampliamente utilizadas por su actividad farmacológica como ansiolíticos. Su mecanismo de acción consiste en la potenciación de la actividad del neurotransmisor inhibitorio, el ácido gama amino butírico (GABA). La actividad de las BDZ se ejerce por medio de su unión a un sitio alostérico al de GABA, localizado en una de las subunidades que constituyen el receptor GABAA (R-GABAA), una proteína integral de membranas plasmáticas neuronales del sistema nervioso central de mamíferos (1).           Estudios teóricos sobre relación estructura-actividad de las BZDs demostraron que los análogos de alta afinidad interaccionan con tres sitios catiónicos en el R-GABAA, los grupos electrofílicos en la benzodiazepina son los sustituyentes ubicados en C7, el grupo C2=O y el nitrógeno iminíco N4. La interacción de N4 con el modelo de receptor, se ve favorecida por la presencia de halógenos en C’2 y cuando el anillo fenilo está rotado en el sentido de otorgar una mayor coplanaridad entre el fenilo y el plano C’1 - C5=N4  (2). En consecuencia, la modificación química en la posición  N1 podría mantener su capacidad de unirse al receptor dado que los puntos electrofílicos claves no estarían (al menos químicamente) afectados.           Esta modificación en la estructura química de las BZDs las transformaría en  compuestos anfipáticos eventualmente capaces de unirse al R-GABAA por su extremo hidrofílico y de incorporarse en la región no polar de las biomembranas por su extremo hidrofóbico constituido por la cadena hidrocarbonada unida en la posición N1. Nuestro interés en este N1-acil-BZD radica en su utilidad como precursor para la obtención de: a) una sonda para evaluar la organización molecular en biomembranas, en las proximidades del R-GABAA, y b) de un sistema de micropartículas recubiertas con un filme fino en cuya superficie se expondría el grupo benzodiazepina y que sería utilizado como un sistema de afinidad para purificar el receptor GABAA, capaz de reemplazar a los métodos tradicionales de inmunoprecipitación y de esta forma evitar el requerimiento de anticuerpos monoclonales (3).           En este trabajo se presenta la síntesis de 5-(2-hidroxifenil)-7-nitro-benzo[e][1,4]diazepin-2(3H)-onas con diferentes cadenas alifáticas en la posición del N1 (ABZD). La metodología de N-alquilación consiste en tratar la benzodiazepina con metóxido de sodio para lograr la formación de la sal sódica, la cual posteriormente reacciona con bromuros de alquilo para dar el derivado N-sustituído (esquema 1). Asimismo, se demuestra la capacidad de este compuesto de incorporarse y de estabilizarse en una interfase lípido-agua cuyas condiciones de organización intermolecular son similares a las encontradas en las biomembranas.   1                                                                                            2 Esquema 1   Metodología   Síntesis de n-alquilbenzodiazepinas:             Se preparó la sal sódica de la benzodiazepinona 1 (clonazepam) colocando 0.480g (1.52 mmoles) de 1 y 1.85 mmoles de metóxido de sodio en 25 ml de metanol de acuerdo a lo descripto en la literatura (4). La mezcla fue agitada a reflujo por 15 min y posteriormente se agregaron 2.26 mmoles de bromuro de alquilo. La reacción se mantuvo a reflujo por 12h. Luego de concluida la síntesis se eliminó el solvente de reacción al vacío y se realizó un prefiltrado del crudo obtenido. Para el aislamiento del producto 2 (ABDZ), se realizaron placas preparativas utilizando como solvente de elución Hexano: Acetato de Etilo (80:20) y Éter de Petróleo: Acetato de Etilo: Etanol (95:4:1).La identificación de las N-alquilbenzodiazepinonas se realizó por Resonancia Magnética Nuclear de 1H y 13C.   Comportamiento de la ABDZ en la interfase agua-aire Se prepararon capas monomoleculares de dipalmitoilfosfatidil colina (dpPC) en la interfase agua-aire. Se utilizó un equipo Minitrough II (KSV, Finlandia) capaz de medir la presión de superficie con una precisión de 0,004 mN/m por el método de la placa de Wilhelmy y el potencial de superficie con una precisión de ± 3 mV, por la técnica de la placa vibratoria. Se realizaron dos tipos de experimentos (5): a) Curvas de penetración/adsorción a la interfase. Las monocapas de dpPC se prepararon a 37°C. Se esperaron 5 minutos para que se evapore el solvente y se estabilice la monocapa hasta obtener una línea de base constante, a la presión inicial (pi) deseada. Luego se inyectó una disolución de ABZD en la subfase acuosa (8 ml, 15,9 cm2 de área superficial), mientras se agitaba continuamente con un barrita magnética cubierta de teflón a 150-250 rpm, alcanzando una concentración final de 0,4 mg/ml de ABZD. Se midió el cambio en la presión de superficie (p) en función del tiempo hasta alcanzar un plateau en donde p=pmax. Las curvas de penetración se utilizaron para construir un gráfico del cambio en la presión de superficie (Dp = pmax-pi)  en función de la presión inicial (pi) y determinar el máximo valor de presión inicial que permite la penetración de la droga en la monocapa, denominada presión inicial de ²cut off” o presión límite (pcut off). Este último parámetro corresponde al valor de pi para la cual se obtiene un Dp igual a cero. b) Isotermas de compresión. Se utilizó una cuba rectangular, provista de dos barreras que se mueven sincrónicamente por medio de un control electrónico. La información correspondiente al área total de la monocapa (determinada automáticamente por el Minitrough II, según la posición relativa de las dos barreras de compresión) y a la señal de salida de los transductores de presión de superficie (también medido automáticamente por el equipo con una placa de Pt platinizada de 5 mm de ancho, 20 mm de largo y 0,025 mm de espesor) y de potencial de superficie (placa vibratoria) fueron tomadas por una computadora personal mediante una interfase en serie, usando un programa específico (LB-Systems versión 3.7 y Sigma 70 versión 4.2). A partir de las isotermas p-A, se calculó el valor del módulo de compresibilidad de estas monocapas en función de las áreas (ver refs. en 4):                                                                       [1] donde Ap es el área molecular a una presión de superficie dada. Este parámetro refleja el estado físico de la monocapa y permitió evaluar el efecto de ABZD sobre la elasticidad de la membrana y definir las transiciones bidimensionales de fase de la monocapa con mayor precisión que las isotermas p-A.   Resultados             Por medio de una metodología sencilla, se obtuvieron derivados benzodiazepínicos conteniendo cadenas alifáticas mayores a ocho átomos de carbono unidas a la posición N1. Cabe señalar que además de la incorporación de la cadena alifática a la molécula de diazepina se produce el desplazamiento del halógeno en el anillo fenilo por hidroxilo como consecuencia del medio en el cual se produce la formación de la sal sódica. Sin embargo, este cambio estructural no afectaría las propiedades del derivado benzodiazepínico para ser empleado como sonda. El derivado octílico (ABZD), fue caracterizado en base a su comportamiento en capas monomoleculares en la interfase agua-aire. El ABZD fue capaz de estabilizarse en una interfase agua-aire tanto sólo como en mezclas con un fosfolípido (dpPC) a distintas proporciones. A partir del análisis de las isotermas de compresión presión-área (Fig.1a) se determinó una presión de colapso para las monocapas de ABZD puras de 7 mN/m. Las mezclas de ABZD-dpPC presentaron una disminución de su estabilidad, respecto a la dpPC pura, a medida que aumentó la proporción de ABZD, evidenciada por la disminución en la presión de colapso, la cual varió desde 59 mN/m a una fracción molar de dpPC xdpPC=1 hasta un valor de 43 mN/m a xdpPC=0.6. También se evidenció una transición bidimensional a p menores a la pc (presión de colapso), cuyo valor disminuyó a medida que aumentó la proporción de ABZD en la mezcla. Estos resultados sugieren la coexistencia de dos fases mezcla en la misma monocapa, a 0.3<xABDZ<0.4 , cada una de ellas con distinta composición (ver diagrama de fase Fig.1b); mientras que a xABDZ<0.3 y xABDZ>0.4 habría un mezcla rica en dpPC y en ABDZ, respectivamente. Ambas mezclas muestran una desviación positiva de la idealidad (Fig.2). Por otra parte, considerando un nivel de empaquetamiento molecular constante (p=cte), fue posible determinar que la presencia de ABZD indujo un aumento significativo en el potencial de superficie. Además, ABZD fue capaz de incorporarse desde la subfase acuosa hacia una monocapa de dpPC empaquetada a 35 mN/m. Tomados en conjunto estos resultados indican que ABZD será capaz de incorporarse a biomembranas, cuya presión de equilibrio es 35 mN/m, y que, una vez incorporada, podrá permanecer en la fase bicapa, dadas las bajas proporciones molares a las que normalmente se usan las sondas.      Fig 1: Comportamiento de las mezclas de ABDZ/dpPC en la interfase agua-aire. (a) Isotermas de compresión p-Área. Los números indican la fracción molar de ABDZ en la mezcla. (b) Diagrama de Fases construido a partir de valores de  pcol  tomados de las isotermas de compresión.   Transiciones bidimensionales de fase típicas de dpPC pura.                         Fig 2: Gráficos de área molecular promedio en función de la fracción molar de ABDZ a p=cte. Las líneas rectas representan el comportamiento esperable en casos de no mezcla o de mezcla ideal de los componentes.   Referencias 1-Mehta K.A., Ticku K.M. Brain Res. Reviews 1999, 29, 196-217. 2- Loew G.H., Nienow J.R. and Poulsen M., Molec. Pharmacol. 1984, 26,19-34. 3- Duggan J.M., Pollard S. and Stephenson F.A., The J. Biol. Chem. 1991, 226, 24778-24784. 5- Sternbach, L. H. Reeder, E. J. Am. Chem. Soc. 1961, 26, 4936. 4- Turina A. del V., Nolan M. V., Zygadlo J.A. y Perillo M. A., Biophys. Chem. en prensa.