INVESTIGADORES
GIOVAMBATTISTA Guillermo
congresos y reuniones científicas
Título:
Desarrollo de un Método de Genotipificación de SNPs del Gen Ela-DRA basado en la Tecnología de Pirosecuenciación
Autor/es:
DÍAZ S.; ECHEVERRÍA M.G.; POSIK D.M.; ROGBERG A.; PERAL GARCÍA P.; GIOVAMBATTISTA G.
Lugar:
San Luís
Reunión:
Congreso; XXXV Congreso Argentino de Genética; 2006
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Genética
Resumen:
La detección de variaciones puntuales o SNPs ha sido utilizada para caracterizar secuencias alélicas, identificar haplotipos y analizar niveles de expresión en los genes del MHC, mediante técnicas tales como PCR-RFLP, PCR-SSCP y SBT. Los métodos de tipificación rápidos, de alta fidelidad y a gran escala son de gran utilidad en el estudio de asociaciones entre marcadores genéticos y susceptibilidad/resistencia. Entre las tecnologías de alta performance recientemente desarrolladas se encuentra la pirosecuenciación. Esta tecnología se basa en la detección del pirofosfato liberado durante la polimerización del ADN, el cual es convertido en ATP y es utilizado por una luciferasa para convertir luciferina en oxiluciferina. Por cada adición de un nucleótido se genera emisión de luz, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de nucleótidos incorporados. Con el objeto de diseñar un método de detección de SNPs por pirosecuenciación para el locus ELA-DRA, se analizaron las secuencias alélicas reportadas. Se seleccionaron las posiciones de nucleótidos variables que permitían diferenciar los distintos alelos y se diseñó un primer interno de secuenciación. El segundo exón se amplificó por PCR utilizando un primer biotinilado, y la cadena biotinilada purificada se empleó como molde de la reacción de pirosecuenciación, utilizando el primer interno de secuenciación. El método fue validado utilizando ADNs de 121 caballos analizados mediante PCR-SSCP. La comparación de las secuencias obtenidas con las de referencia permitió validar el método e identificar los alelos previamente reportados. Estos resultados evidencian que el método desarrollado es de utilidad para su aplicación a gran escala en estudios poblacionales y de asociación con enfermedades.
