Fosforil colina fosfatasa de P.aeruginosa: Reacción enzimática en distintos médios

CECILIA CHALLIER; PAOLA BEASSONI; A. TERESITA LISA; M.A. BIASUTTI

Salta

Congreso; Congreso Argentino de Fisicoquimica y Quimica Inorganica; 2009

Asociacion Argentina de Fisicoquimica

Las enzimas son catalizadores biológicos proteicos cuyo poder catalítico es mucho mayor que elde los catalizadores inorgánicos. En medios organizados tales como micelas inversas y directas,la actividad enzimática suele ser más alta que en agua (fenómeno de superactividad) y laestabilidad de la enzima se puede mejorar mediante un cuidadoso diseño del medio micelar. Enlos estudios de reacciones enzimáticas, si bien la parte preponderante de los mismos se hallevado a cabo en micelas inversas del surfactante aniónico AOT, en solventes tales como isooctano,ciclohexano, etc., también se utilizan otros surfactantes como por ejemplo para micelasdirectas: dodecil sulfato de sodio (SDS, surfactante aniónico), bromuro de cetil trimetil amonio(CTAB, surfactante cationico), y Triton X-100 (surfactante no ionico), etc.La enzima en estudio es la Fosforilcolina fosfatasa (PchP) de P.aeruginosasobreexpresada en E. coli. La reacción enzimática fue ensayada en buffer AcH/NaAc apH 5,5 en presencia de MgCl2 y el sustrato p-nitro fenil fosfato de Sodio (pNPP). Dichaenzima ha sido investigada previamente debido a su relevancia en la patogénesis dePseudomonas aeruginosa, ya que facilita la colonización en el huésped de un procesoinfeccioso. La cinética de la reacción enzimática, se estudió a través de la determinaciónde las velocidades iniciales (vo) de la reacción, seguidas por espectroscopia UV-Visiblea través de la formación del producto (p-nitro fenol) a 410 nm, por método continuo.Con el objeto de investigar la influencia de distintos medios sobre la mencionadareacción enzimática y su eficiencia, el estudio se realizo en medio homogéneo, enmicelas Inversas de Cloruro de bencilhexadecil dimetil amonio (BHDC) y en micelasdirectas de Triton-X100. En medio homogéneo el comportamiento responde a unacinética de Michaelis-Menten pudiéndose determinar los parámetros cinéticos:constante de catálisis (kcat) y la constante de Michaelis – Menten (KM) para la reacciónenzimática como asimismo su eficiencia catalitica (kcat/ KM). En micelas inversas deBHDC en benceno se observaron, gráficos atípicos de Michaellis- Menten lo que nosindujo a sospechar que BHDC, que es una sal de amonio cuaternaria, se podría estarcomportando como un inhibidor de la reacción enzimática. Por tal motivo, procedimosal estudio de las velocidades en función de la concentración de BHDC. Las rectasobtenidas a partir de la representación grafica de la Ecuación de Dixon: 1/V vs [BHDC]= [I] para diferentes valores de [sustrato] permitieron obtener de la intersección de lasdos rectas el valor de la constante de inhibición Ki ([I] = - Ki). El mecanismo deinhibición competitiva fue confirmado a través de la representación grafica de laecuación de Cornish- Bowden ([S]/V vs [BHDC]). En micelas directas de Triton-X100el comportamiento parece indicar que hay un efecto activador por parte del surfactanteno iónico. Por otro lado, se realizaron determinaciones de anisotropía (r) y tiempos devida de fluorescencia para la enzima en medio homogénea y en los medios micelares.