Identificación de una proteína quinasa involucrada en la fosforilaciòn de CNBP durante el desarrollo embrionario del pez cebra

LOMBARDO, VERÓNICA A.; CALCATERRA, NORA B.

Rosario, Santa Fe, Argentina

Congreso; VIII Congreso y XXVI Reunión anual de la Sociedad de Biología de Rosario (SBR).; 2006

SBR

La proteína celular de unión a ácidos nucleícos (CNBP) es una proteína de unión a ácidos nucleicos simple hebra ampliamente distribuida en el reino animal. Se conoce que CNBP es esencial para el desarrollo normal del cerebro anterior en embriones de ratón (Chen et al., 2003) y pollo (Abe et al., 2006). En anfibios y peces, CNBP presenta una localización dual durante la embriogénesis, produciéndose una translocación del citoplasma al núcleo que comienza durante el estadio de gástrula tardía – inicio del período de segmentación (Armas et al., 2001; Armas et al., 2004). CNBP presenta un alto grado de conservación de secuencia, presentando siete nudillos de zinc del tipo CCHC, una caja RGG, una señal de localización nuclear, un sitio putativo de proteólisis y varios sitios putativos de fosforilación en Ser y Thr. En nuestro laboratorio hemos demostrado que CNBP es fosforilada tanto in vitro como in vivo, y que la fosforilación es diferencial durante el desarrollo embrionario. El nivel de fosforilación presenta un nivel basal, el cual empieza a  aumentar en el estadio de 17 somitos hasta alcanzar un valor máximo en el estadio de 48 hpf a partir del cual desciende hasta alcanzar los valores iniciales. El nivel máximo de fosforilación coincide con el momento de translocación, por lo que ambos eventos podrían estar relacionados. También, hemos demostrado que la quinasa responsable es una Ser/Thr quinasa. Para dilucidar que quinasa podría estar fosforilando a CNBP decidimos realizar un análisis in sílico de la secuencia de CNBPs de diferentes especies con el fin de identificar sitios putativos de fosforilación. De los sitios putativos encontrados, un único sitio de fosforilación se encuentra conservado. Dicho sitio es reconocido por una proteína quinasa dependiente de cAMP (PKA) e involucra al residuo contiguo al séptimo nudillo de zinc, siendo Ser158 en el caso de pez cebra. En ensayos de fosforilación in vitro en presencia de diferentes inhibidores de quinasas, observamos inhibición al utilizar H-89 y PKI, dos inhibidores de PKA. Para identificar al aminoácido fosfo-aceptor, construimos una mutante puntual de CNBP, en la cual reemplazamos la Ser158 por Ala (CNBPS158A). CNBPS158A no fue capaz de ser fosforilada in vitro durante el desarrollo embrionario de pez cebra, sugiriendo que Ser158 es el residuo fosfo-aceptor de CNBP. El alto grado de conservación del sitio específico para PKA presente en todas las especies de vertebrados analizadas sugiere que la fosforilación diferencial de CNBP podría tener una función biológica durante la embriogénesis de vertebrados.