Arquitectura cromatínica e "insulators" en la regulación génica de neuropéptidos hipotalámicos de mamíferos

RUBINSTEIN M; CHASELON D; DE SOUZA FS; CAMARANO AC

Chascomús

Taller; IV Taller de Biologia Celular y del Desarrollo.; 2018

Centro Nacional de Biotecnología (CSIC-UAM) y Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP)

Oxitocina y vasopresina son neuropép=dos que se expresan en las neuronas magnocelulares de los núcleos paraventricular y supraóp=co del hipotálamo. Sus funciones son variadas e incluyen la regulación de la osmolaridad de los fluidos corporales, la contracción del músculo liso del útero y glándula mamaria y el cuidado parental. Ambos genes son muy similares en secuencia y se localizanuno al lado del otro, transcribiéndose en orientaciones opuestas. A pesar de ser genes homólogos y estar uno al lado del otro, la regulación de ambos es dis=nta, dado que, tanto en el SON como en el PVN, oxitocina y vasopresina son sintetizados en poblaciones separadas de neuronas, lo que sugiereque cada uno de los genes se encuentra aislado de la influencia regulatoria del gen vecino. El estudio del locus de oxitocina-vasopresina mediante bases de datos mostró que existe un sitio de pegado de CTCF entre ambos genes y otro río arriba de AVP que podrían estar actuando como insulators. Los insulators son pequeños elementos de DNA distribuidos por los cromosomas que pueden interaccionar entre sí, formando loops de cromatina. Las regiones insulator de vertebrados se unen directamente a una proteína tipo zinc-finger denominada CTCF Los loops, que en general incluyen un gen, aíslan una unidad transcripcional de la influencia regulatoria de los enhancers de otros loci. Para determinar la función de estos putativos insulators en ratón estamos utilizando la técnica demutagénesis sitio-dirigida de CRISPR-Cas9 para eliminar ambos sitios de unión de CTCF en ratones. Los ratones mutantes para uno, el otro o ambos insulators serán analizados en detalle para detectar cambios en la expresión del locus de Oxt-Avp, además de los loci vecinos, utilizando técnicas de inmunohistoquímica, hibridación in situ y RT-PCR. Además estamos comprobando mediante ChIP elpegado de CTCF en dichas regiones en células de hipotálamo de ratón y una vez obtenidos los ratones mutados estudiaremos la expresión del locus en animales some=dos a estrés salino para determinar cómo se altera la regulación de los genes en ausencia de los insulators.