Estudio funcional del receptor de glucocorticoides en la leucemia, eventos epigenéticos involucrados en la muerte celular

LUCIANA ROCHA VIEGAS

Congreso; LIX Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica; 2014

Muchas de las características distintivas del cáncer como el bloqueo de la diferenciación y la evasión de la muerte celular se encuentran profundamente influenciadas por cambios en el epigenoma. Las modificaciones epigenéticas que subyacen en el patrón de expresión génica alterado en tumores, y que ocurren como consecuencia del reclutamiento anormal de actividades enzimáticas desacetilasas y metilasas, resultan ser muy útiles como biomarcadores, tanto para detectar enfermedades, como para predecir la eficacia terapéutica en pacientes con cáncer. Asimismo resulta crucial mejorar nuestra comprensión de los mecanismos de acción de las terapias epigenéticas de manera de poder preveer los potenciales efectos adversos a largo plazo sobre la estructura de la cromatina. En la epigenética del cáncer actualmente es posible focalizarse no sólo en la actividad catalítica de estos reguladores epigenéticos de manera específica, sino también en las interacciones proteína-proteína que localizan a muchos de esos factores en la cromatina. Si bien no todos los cánceres son igualmente susceptibles a las terapias epigenéticas, las enfermedades hematopoyéticas son claramente más vulnerables a este tipo de intervenciones que los tumores sólidos. Las leucemias, que se dividen en formas crónicas y agudas, son enfermedades malignas de las células hematopoyéticas, en las cuales el balance entre proliferación, diferenciación y apoptosis deja de ser el adecuado. Los glucocorticoides son potentes reguladores de la supervivencia celular. Sin embargo, el destino final de las células sujetas a la acción de estas hormonas puede ser diametralmente opuesto según la estirpe a la que pertenezcan. Los glucocorticoides sintéticos, como la dexametasona, son utilizados con frecuencia en el tratamiento de enfermedades de origen hematopoyético debido a sus propiedades pro-apoptóticas. A pesar de que los mecanismos desencadenados sobre células leucémicas aún no son claros, estas hormonas esteroideas constituirían una terapia alternativa, donde la unión a sus receptores iniciaría cascadas de señalización con el consecuente reclutamiento de maquinarias modificadoras de la cromatina, co-activadores y/o co-represores específicos sobre genes blanco. De aquí mismo se desprende el objetivo general de nuestro trabajo, donde nos proponemos estudiar los factores y los eventos epigenéticos involucrados en la inducción de apoptosis por los glucocorticoides sobre células leucémicas mieloides humanas. Nuestra hipótesis se basa en que gran parte del patrón de expresión génica que tiene lugar en un contexto celular tumoral es consecuencia de un reclutamiento anómalo de enzimas que participan en la regulación de la cromatina, y el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que involucran la modificación de dichas actividades enzimáticas resultaría muy prometedor para aliviar este tipo de enfermedades. En nuestro laboratorio estudiamos la participación de dos factores con relevancia epigenética, ASH2L y NCoA6, sobre la apoptosis mediada por los glucocorticoides en células leucémicas. Por un lado, ASH2L está fuertemente asociado a la leucemia y forma parte del complejo con actividad de histona-metiltransferasa de la lisina 4 de la histona H3 (H3K4), y por el otro, NCoA6 es un co-activador de receptores nucleares. En células leucémicas humanas U937 salvajes habíamos observado que el glucocorticoide sintético dexametasona aumenta de manera significativa la apoptosis, mientras que células con una expresión disminuida de las proteínas ASH2L y NCoA6 (shASH2L y shNCoA6) mostraban un retardo en la inducción de la muerte celular. Estas primeras evidencias fisiológicas nos sugirieron que tanto ASH2L como NCoA6 tendrían un rol fisiológico en el mecanismo por el cual los glucocorticoides a través de su receptor median la respuesta apoptótica en estas células leucémicas. A continuación analizamos la expresión del gen bcl-X (utilizado como modelo para evaluar respuesta a esteroides) y observamos una disminución en el nivel de expresión de la isoforma anti-apoptótica bcl-XL en células U937 salvajes tratadas, mientras que en células shASH2L y shNCoA6 no se observaron diferencias significativas con el tratamiento. Correlacionando todo lo anterior, tanto ASH2L como NCoA6 participarían como putativos moduladores epigenéticos en la regulación que el receptor de glucocorticoides (GR) ejerce sobre la expresión del gen bcl-X, necesaria para una adecuada muerte de las células leucémicas en respuesta a los glucocorticoides. Se realizaron co-inmunoprecipitaciones de proteínas con extractos nucleares provenientes de células salvajes y células shNCoA6, control y tratadas con dexametasona. En las células salvajes control se observó una interesante y hasta el momento no descripta interacción del GR con el factor ASH2L, que fue aun mas intensa en presencia de hormona. Esta novedosa interacción resultó ser dependiente de la presencia del co-activador NCoA6, ausente en células shNCoA6. Por otro lado, se llevaron a cabo ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en células salvajes, células shASH2L y células shNCoA6, control y tratadas, donde se estudió el reclutamiento del GR a sus elementos de respuesta (HREs) presentes en el intrón del gen bcl-X humano. Los resultados mostraron que GR se encuentra previamente unido al DNA en células salvajes control, pero se despega tras el agregado del esteroide a estas células leucémicas. Este reclutamiento resultó ser dependiente del co-activador NCoA6, dado que en células shNCoA6 control y tratadas no se observó estabilidad en la unión del GR a los HREs de bcl-X. Por otro lado, los niveles de GR asociados al DNA en células shASH2L control aumentaron en presencia de la hormona, sugiriendo que es el factor ASH2L el responsable del despegado del GR de sus sitios blanco. En su conjunto, los datos hasta aquí presentados indicarían que los glucocorticoides inducen apoptosis en células leucémicas mediante la interacción del GR con el factor ASH2L, que inhibiría el reclutamiento del receptor a sus sitios blanco localizados en el intrón del gen bcl-X, con la consecuente disminución en los niveles de expresión de la isoforma anti-apoptótica bcl-XL. El co-activador NCoA6 sería esencial para la estabilidad del complejo GR-ASH2L per se y de su reclutamiento al DNA.