Nuevos promotores potencialmente constitutivos y regulables para sistemas de expresión de bacterias ácido lácticas

GLORIA DEL SOLAR; JOSÉ LUIS BARRA; JAVIER NICOLÁS GARAY NOVILLO; JOSÉ ÁNGEL RUIZ MASÓ

Sevilla, Instituto de la Grasa - CSIC

Congreso; 12ª Reunión de la Red Española de Bacterias Lácticas; 2018

Red Española de Bacterias Lácticas

Introducción: Las Bacterias Ácido Lácticas (BAL), clasificadas como ?microorganismos seguros para su uso en producción alimenticia? por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA), representan prometedoras biofactorías para la producción más segura de proteínas recombinantes. Los sistemas de expresión constitutivos o regulados en estas plataformas biotecnológicas son aún limitados, por lo que el desarrollo de vectores versátiles para expresión génica (ya sea regulada, limitada por la disponibilidad y acceso de un inductor, o constitutiva, sin representar una carga metabólica excesiva para la célula) es una necesidad actual.Objetivos: Con el fin de expandir las herramientas moleculares para la construcción de sistemas de expresión para BAL, se identificaron y aislaron secuencias promotoras propias de Lactococcus lactis que funcionaran tanto en esta bacteria como en Escherichia coli. La actividad diferencial de los promotores en estos dos huéspedes podría ser útil para detectar regiones genómicas regulables.Materiales y Métodos: El DNA genómico de L. lactis subsp. cremoris MG1363 (LLMG) fue aislado y digerido con dos enzimas de restricción; los fragmentos resultantes en el rango de 0,4 a 3 kbp fueron clonados en el vector bifuncional pTLGR, que contiene la secuencia codificante de mCherry como reportero fluorescente para el análisis de promotores. La actividad promotora de estas regiones fue inicialmente analizada en E. coli para identificar promotores potencialmente regulados en L. lactis y regiones activas en ambos organismos. Estos fragmentos fueron secuenciados y analizados bioinformáticamente en búsqueda de la región promotora mínima. Se seleccionaron cuatro regiones mínimas que fueron clonadas en los vectores pTLGR y pRCR para el estudio de su actividad promotora en E. coli y L. lactis, respectivamente. Para la caracterización de la actividad promotora se utilizó el promotor P5N8 como referencia, siendo éste uno de los promotores constitutivos más fuertes descritos para L. lactis (Zhu D., et al., 2015). La actividad de los distintos promotores se analizó en LLMG y E. coli DH5α en diferentes medios de cultivo por microscopía de fluorescencia y se cuantificó por espectrofluorímetro Varioskan.Resultados: Cuatro de las regiones genómicas de LLMG analizadas exhibieron actividad promotora fuerte en E. coli. Sin embargo, en LLMG solo tres de estas regiones presentaron una actividad promotora mayor que el promotor constitutivo P5N8, mientras que con la región PG2, correspondiente al promotor del gen de la glicerol kinasa (glpK ?llmg_1099?), no se detectó actividad alguna. Las tres regiones promotoras fuertes en LLMG se denominaron PR1, PR2 y PG1, y corresponden a regiones promotoras asociadas al gen de la subunidad IIAB del transportador PTSMan (ptnaAB ?llmg_0729?), al operón de un sistema tipo II toxina-antitoxina RelBE/ParDE (?llmg_1348? y ?llmg_1347?), y al gen de una proteína de unión a DNA tipo histona HU (HllA ?llmg_0496?), respectivamente. Los resultados de este análisis son congruentes con los del estudio de actividad transcriptómica en LLMG descrita por van der Meulen S. B,. et al. (2016). El análisis de secuencia de PR1 y PG2 muestra la presencia de posibles sitios cre de unión a CcpA, sugiriendo una posible regulación por represión por catabolito.Conclusiones: La caracterización de estos nuevos promotores potencialmente constitutivos fuertes o inducibles puede ser de particular interés para investigación básica y/o aplicaciones industriales.