RESOLVIENDO PROBLEMAS EN INVESTIGACIÓN EXPERIMENTAL: ELECTROFISIOLOGÍA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE RECEPTORES GABAA DE NEURONAS HIPOTALÁMICAS DE EMBRIONES DE RATA

MIR F.R

Córdoba

Encuentro; III Encuentro de Jóvenes Investigadores en Neurociencias: un enfoque interdisciplinario; 2011

Jóvenes Investigadores en Neurociencias - UNC

El tamaño muestral para experimentos de electrofisiología en configuración de célula entera suele ser de 6 a 10 neuronas. Si la respuesta es lo suficientemente estable entre célula y célula, buenas interpretaciones se pueden desprender de esos resultados. Sin embargo, cuando la respuesta es variable o se divide en categorías es conveniente aumentar el número de casos para confirmar cualquier tendencia. Así como el número de réplicas, las condiciones experimentales en las que se llevan a cabo las investigaciones son un determinante indiscutido de la calidad de los resultados que se obtienen mediante experimentación. El siguiente trabajo intenta mostrar la importancia de éstos dos parámetros en la interpretación de resultados obtenidos en el marco de mi proyecto de tesis doctoral. En dicho proyecto nos propusimos estudiar la existencia de diferencias sexuales en la composición de subunidades de los receptores GABAA (GABAAR) en machos y hembras mediante experimentos de electrofisiología y de expresión de ARNm de las subunidades en cultivos de neuronas hipotalámicas sexualmente diferenciados. Metodología y Resultados: En un primer set de experimentos se realizó una caracterización farmacológica de los GABAAR en neuronas hipotalámicas de embriones de E16 de machos y hembras. Por medio de registros en célula entera, se obtuvo la respuesta a diferentes dosis de GABA de células de 2 y 9 DIV. Se analizó también los porcentajes de potenciación/inhibición de corrientes evocadas por GABA 10 µM en presencia de moduladores alostéricos tales como diazepam (1 µM), alfaxalona (50 µM), propofol (5 µM), Zn+2 (1 µM), furosemida (500 µM) y etanol (1, 10, 50, 100 and 200 mM). No se encontraron diferencias significativas entre machos y hembras en la sensibilidad al GABA mediante la comparación de los respectivos EC50. La evaluación de los porcentajes de potenciación/inhibición de los moduladores tampoco mostró diferencias sexuales. Sin embargo etanol potenció las corrientes GABAérgicas solo en neuronas hipotalámicas de hembra. Para dilucidar si esa diferencia funcional estaba relacionada a diferencias en la expresión de las subunidades de GABAAR, se extrajo el ARNm de cultivos de 2 DIV sexualmente diferenciados. Se realizó una RT-PCR para amplificar las subunidades de GABAAR (Į1-6, ȕ1-3, 1-3, į) y ȕ-actina como control. El análisis del patrón de expresión de las subunidades de tres cultivos independientes mostró que la mayoría de las subunidades estaban presentes en neuronas de ambos sexos excepto Į6 y į que no se expresan en machos ni hembras, mientras que la subunidad Į4 se expresa exclusivamente en neuronas derivadas de fetos hembra. En un segundo set de experimentos incrementando el número de réplicas en ambos sexos, neuronas hipotalámicas de embriones macho mostraron, al igual que las hembras, potenciación de las corrientes GABAérgicas en respuesta a etanol. Es más, usando moduladores específicos de GABAAR que contienen la subunidad Į4 no se hallaron diferencias sexuales en los porcentajes de potenciación/inhibición. Nuevos experimentos de RT-PCR usando una polimerasa ultra sensible mostraron que la subunidad Į4 se expresa en neuronas macho y hembra. Además se encontraron productos de amplificación específicos de las subunidades Į6 y į en ambos sexos. Conclusión: Nuestros datos confirman tanto a nivel funcional como de expresión que las subunidades de los GABAAR de neuronas hipotalámicas de embriones de rata de E16 no son diferentes en machos y hembras. A la vez se evidencia la importancia de un buen tamaño muestral y de las condiciones de experimentación para la obtención de resultados relevantes y confiables.