INIMEC - CONICET   05467
INSTITUTO DE INVESTIGACION MEDICA MERCEDES Y MARTIN FERREYRA
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
RESOLVIENDO PROBLEMAS EN INVESTIGACIÓN EXPERIMENTAL: ELECTROFISIOLOGÍA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE RECEPTORES GABAA DE NEURONAS HIPOTALÁMICAS DE EMBRIONES DE RATA
Autor/es:
MIR F.R
Lugar:
Córdoba
Reunión:
Encuentro; III Encuentro de Jóvenes Investigadores en Neurociencias: un enfoque interdisciplinario; 2011
Institución organizadora:
Jóvenes Investigadores en Neurociencias - UNC
Resumen:
El tamaño muestral para experimentos de electrofisiología en configuración
de célula entera suele ser de 6 a 10 neuronas. Si la respuesta es lo
suficientemente estable entre célula y célula, buenas interpretaciones se
pueden desprender de esos resultados. Sin embargo, cuando la respuesta
es variable o se divide en categorías es conveniente aumentar el número de
casos para confirmar cualquier tendencia. Así como el número de réplicas,
las condiciones experimentales en las que se llevan a cabo las
investigaciones son un determinante indiscutido de la calidad de los
resultados que se obtienen mediante experimentación. El siguiente trabajo
intenta mostrar la importancia de éstos dos parámetros en la interpretación
de resultados obtenidos en el marco de mi proyecto de tesis doctoral. En
dicho proyecto nos propusimos estudiar la existencia de diferencias sexuales
en la composición de subunidades de los receptores GABAA (GABAAR) en
machos y hembras mediante experimentos de electrofisiología y de
expresión de ARNm de las subunidades en cultivos de neuronas
hipotalámicas sexualmente diferenciados.
Metodología y Resultados: En un primer set de experimentos se realizó una
caracterización farmacológica de los GABAAR en neuronas hipotalámicas de
embriones de E16 de machos y hembras. Por medio de registros en célula
entera, se obtuvo la respuesta a diferentes dosis de GABA de células de 2 y
9 DIV. Se analizó también los porcentajes de potenciación/inhibición de
corrientes evocadas por GABA 10 µM en presencia de moduladores
alostéricos tales como diazepam (1 µM), alfaxalona (50 µM), propofol (5 µM),
Zn+2 (1 µM), furosemida (500 µM) y etanol (1, 10, 50, 100 and 200 mM). No
se encontraron diferencias significativas entre machos y hembras en la
sensibilidad al GABA mediante la comparación de los respectivos EC50. La
evaluación de los porcentajes de potenciación/inhibición de los moduladores
tampoco mostró diferencias sexuales. Sin embargo etanol potenció las
corrientes GABAérgicas solo en neuronas hipotalámicas de hembra. Para
dilucidar si esa diferencia funcional estaba relacionada a diferencias en la
expresión de las subunidades de GABAAR, se extrajo el ARNm de cultivos
de 2 DIV sexualmente diferenciados. Se realizó una RT-PCR para amplificar
las subunidades de GABAAR (Į1-6, ȕ1-3, 1-3, į) y ȕ-actina como control.
El análisis del patrón de expresión de las subunidades de tres cultivos
independientes mostró que la mayoría de las subunidades estaban presentes
en neuronas de ambos sexos excepto Į6 y į que no se expresan en machos
ni hembras, mientras que la subunidad Į4 se expresa exclusivamente en
neuronas derivadas de fetos hembra. En un segundo set de experimentos
incrementando el número de réplicas en ambos sexos, neuronas
hipotalámicas de embriones macho mostraron, al igual que las hembras,
potenciación de las corrientes GABAérgicas en respuesta a etanol. Es más,
usando moduladores específicos de GABAAR que contienen la subunidad Į4
no se hallaron diferencias sexuales en los porcentajes de
potenciación/inhibición. Nuevos experimentos de RT-PCR usando una
polimerasa ultra sensible mostraron que la subunidad Į4 se expresa en
neuronas macho y hembra. Además se encontraron productos de
amplificación específicos de las subunidades Į6 y į en ambos sexos.
Conclusión: Nuestros datos confirman tanto a nivel funcional como de
expresión que las subunidades de los GABAAR de neuronas hipotalámicas
de embriones de rata de E16 no son diferentes en machos y hembras. A la
vez se evidencia la importancia de un buen tamaño muestral y de las
condiciones de experimentación para la obtención de resultados relevantes y
confiables.