La exposición de las retinas bovinas a la luz modula positivamente la activación de la proteína quinasa C alfa (PKCα) y de la diacilglicerol quinasa (DAGK) en la fracción nuclear de fotorreceptores

NATALINI, P.; MATEOS, M. V.; GIUSTO, N. M.; ILINCHETA, M.

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Nacional de Investigación en Visión y Oftalmología; 2012

  El objetivo general del trabajo fue analizar el efecto de la exposición de retinas a la luz en la actividad de la diacilglicerol quinasa (DAGK) y de la proteína quinasa C (PKC) en una fracción rica en núcleos de células fotorreceptoras. Los objetivos particulares fueron a) determinar si la luz, a través de la activación de una fosfolipasa tipo C (PIP2-PLC), genera una respuesta nuclear en la actividad DAGK; b) determinar si la luz modifica el contenido y activación de PKCα; c) evaluar la correlación del efecto lumínico sobre la actividad DAGK a dos temperaturas diferentes. Las retinas fueron obtenidas de ojos bovinos adaptados durante 2 h 30 min a oscuridad (0ºC) y las copas fueron expuestas durante 15 min, en oscuridad, al inhibidor de PIP2-PLC, U73122 (10 μM) ó al vehículo (DMSO 0,01%) y luego expuestas durante 30 min a luz u oscuridad en dichas condiciones. Este procedimiento, se realizó a 0º o a 22º, Las retinas fueron homogenizadas en sacarosa 0.25 M y combinadas con sacarosa 2.2 M para obtener un homogenado 1.6 M, sembrado sobre un gradiente de sacarosas 2.4 M-2.2 M, y centrifugado 70 min. a 25000 rpm. Se obtuvo un pellet altamente purificado en núcleos de células fotorreceptoras (FNF). La pureza del FNF se corroboró por microscopía electrónica y western Blot (W.B). La actividad DAGK en los núcleos de FNF fue detectada midiendo la formación de PA durante 10 min de incubación empleando ATPg32P. El contenido de PKCα total y activada (fosfo PKCα) se detectó mediante WB. Los resultados mostraron que la luz estimula la formación de PA nuclear (67%) y que ese efecto fue revertido por la preincubación con el U73122. Cuando el procedimiento se realizó a 22 ºC los niveles de actividad detectada en el núcleo fueron superiores a los observados a 0º pero el efecto de la luz y la reversión por U73122 fueron proporcionalmente similares. La luz provoca un aumento en el contenido nuclear de PKCα activada respecto a la condición de oscuridad, con niveles similares de PKCα  total. Los resultados indicarían que la exposición a la luz en retina ?in situ?, genera una activación de la PKCα en los núcleos de fotorreceptores, que se debe posiblemente al incremento del DAG producto de la activación de PIP2-PLC, mientras que la transformación del DAG a PA por DAGK operaría como regulador negativo.