Activación química de ovocitos de Rhinella arenarum

MARTA BÜHLER; GRACIELA SÁNCHEZ TORANZO

Curitiba

Congreso; IX Congreso Latinoamericano de Herpetología.; 2011

ACTIVACIÓN QUÍMICA DE OVOCITOS DE RHINELLA ARENARUM Marta Bühler; Graciela Sánchez Toranzo Instituto de Biología- Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia- Universidad Nacional de Tucumán- Argentina En Rhinella arenarum, los ovocitos maduros se encuentran detenidos en la metafase de la segunda división meiótica (MII) por efecto de un factor citoplasmático, el factor promotor de la metafase (MPF) formado por una ciclina B y una quinasa dependiente de ciclina (cdc2). Durante la fecundación el espermatozoide induce en el ovocito la finalización de la meiosis y una serie de procesos que se conocen como activación del ovocito. Uno de los primeros eventos de la activación es la liberación de Ca++ de los reservorios intracelulares que sería responsable de la inactivación del MPF lo que conduce a la exocitosis de los gránulos corticales (GC), la finalización de la meiosis, y la formación de pronúcleos. En los anfibios, el aumento de Ca++ intracelular se inicia en el sitio de entrada del espermatozoide e induce una onda de exocitosis de los GC. Se ha propuesto que el espermatozoide activa la fosfolipasa C con la producción de IP3 (que promueve la salida de Ca2+ del retículo endoplasmático) y de DAG que activa la proteinquinasa C (PKC). La PKC está involucrada en la alcalinización del pH del huevo y estimula la exocitosis de los GC. En el caso de los protocolos de fecundación in vitro o de clonación, se utilizan diferentes procedimientos para activar a los ovocitos, como la estimulación eléctrica, térmica, o la estimulación química, que  llevan al inicio del desarrollo. Sin embargo, los porcentajes de desarrollo normal obtenidos son bajos.  Es por ello que el desarrollo de procedimientos que mimeticen los eventos de la activación producida por el espermatozoide en una fecundación normal, son esenciales para el éxito de estos procedimientos. Trabajos de nuestro laboratorio han demostrado que una lactona sesquiterpénica, la dihidroleucodina (DhL) interfiere con la activación del MPF inducida por la progesterona en ovocitos ováricos de Rhinella arenarum. El efecto inhibidor de la DhL sobre el MPF podría utilizarse para inducir la activación artificial de los ovocitos detenidos en MII.  El propósito de este trabajo es ensayar el efecto inhibidor de la DhL sobre el MPF y la activación de la PKC para inducir activación química en ovocitos de anfibio, tomando como parámetros de activación la exocitosis de los GC y la formación de pronúcleos. Los ovocitos ováricos desnudos de Rhinella arenarum  madurados  in vitro con progesterona 2,5 µM, y se cultivaron con diferentes dosis de DhL  o PMA (activador de la PKC) y la ruptura de los gránulos corticales se determinó en preparaciones citológicas coloreadas con Alcian Blue  pH 2,5 y mediante microscopía electrónica a distintos tiempos de incubación. La capacidad para formar pronúcleos se ensayó microinyectando espermatozoides en los ovocitos tratados con DhL o PMA. La presencia de pronúcleos se determinó en preparaciones citológicas coloreadas con hematoxilina-eosina. Los resultados indican que el tratamiento de los ovocitos maduros con DhL 30 µM induce ruptura de los GC luego de 60 min. de incubación a 25°C. Con dosis menores se logra una exocitosis parcial de los GC. En el caso del tratamiento con PMA (0.5 mgr./ml), la exocitosis de los GC se observó a lo 30 min de incubación. La observación al microscopio electrónico indica que el proceso de exocitosis es similar al de una fecundación normal. Los ovocitos activados con DhL o PMA son capaces de formar pronúcleos. Esto sugiere que  tanto la DhL como el PMA inducen una activación genuina en los ovocitos de Rhinella arenarum madurados in Vitro. .