Caracterizaciòn del perfil inflamatorio de la rata senil con deficit cognitivo: La microglía que sobreexpresa TYROBP como modelo de estudio.

REGGIANI PC; PARDO J; ARIZA S; MOREL GR

La Plata

Jornada; Jornadas de Medicina 2018; 2018

Facultad de Ciencias Médicas

INTRODUCCIÓN: La edad es el componenteetiológico más importante en el desarrollo de las enfermedadesneurodegenerativas. En nuestro laboratorio hemos caracterizado a la rata Sprague Dawley (SD) hembra senil 29-32meses como modelo de envejecimiento cerebral y déficit cognitivo. La Enfermedadde Alzheimer (EA), cuyo principal factor de riesgo es el envejecimiento, estámarcada por eventos neuroinflamatorios que involucran a la glía, incluidos losastrocitos y, en particular, la microglía. Nuestro objetivo general esdilucidar los mecanismos celulares y moleculares de la neurodegeneración tantoen el envejecimiento normal como en la EA.OBJETIVOS: 1- Caracterizar elenvejecimiento cerebral desde el punto de vista del déficit cognitivo y laneuroinflamación del hipocampo.2- Estudiar el transcriptomadiferencial asociado al envejecimiento del hipocampo, una región cerebral claveen la formación y retención de la memoria, e identificar genes proinflamatoriossobreexpresados en la microglia senil.3- Establecerun modelo celular de neuroinflamación en células microgliales.MATERIALES YMÉTODOS: Obj.1: Seutilizaron ratas viejas de 28 meses de edad versusjóvenes de 4 meses. Para estudiar el déficit cognitivo en el envejecimiento seevaluó la memoria espacial en el Laberinto Barnes (LB). Para estudiar laneuroinflamación en el hipocampo se realizó un estudio microscópico de lapoblación microglial, mediante inmunohistoquímica contra Iba1 (ionized calcium-binding adapter molecule 1). Obj.2: Paraestudiar la transcriptómica diferencial se realizó el secuenciamiento de ARN dehipocampo derecho de ratas jóvenes y viejas. Obj. 3: Paraobtener el modelo celular de neuroinflamación construimos dos lentivirus (LV):un bicistrónico que sobreexpresa simultaneamente Tyrobp y la proteinafluorescente verde (GFP) y, otro, que sobreexpresa la proteina quimeraTyrobp-GFP; como control se construyó un LV que codifica sólo para GFP. Lascélulas de microglía de ratón BV2 fueron utilizadas como modelo celular paraevaluar el impacto de la sobreexpresión de Tyrobp.RESULTADOS: Obj.1: Ambosgrupos de ratas mostraron en el LB un adecuado aprendizaje así como un claropico de exploración en el agujero meta, siendo la amplitud de este pico y lavelocidad del aprendizaje significativamente superior en los animales jóvenes.A nivel morfométrico, la declinación cognitiva en la rata vieja viene aparejadade un aumento en la activación microglial en la zona  del Stratumradiatum del hipocampo. Obj.2: Elsecuenciamiento de ARN demostró que 5 genes involucrados en la neuroinflamaciónestán sobreexpresados: C3, CD11b, CD4, CD74 y TYROBP, en el hipocampo de larata vieja. Una vez identificados estos genes proinflamatorios, nos enfocamosen el gen TYROBP, dado que la proteína Tyrobp, entre otras funciones, es unadaptador de superficie celular, media la fagocitocis y la supresión de larespuesta inflamatoria. Dicha proteína se expresa exclusivamente en célulasmicrogliales. Obj.3: Basándonosen los resultados de secuenciamiento de ARN, nos propusimos evaluar el rol de Tyrobpen la activación microglial y la neuroinflamación en las células BV2. Comprobamosla correcta contrucción de los lentivirus: el que sobreexpresa Tyrobp y GFP porseparado (LV-pEF1-Tyrobp-T2A-GFP), el que sobreexpresa la proteina quimeraTyrobp fluorescente verde (LV-pEF1-Tyrobp-GFP) y los respectivos controles, queexpresan solamente GFP (LV-pEF1-Tyrobp-T2A-GFP y LV-pEF1-Tyrobp-GFP). Las BV2se transdujeron con estos LV y, 3 días después, observamos fluorescencia verdedistribuida en la totalidad de la célula para los casos en que la GFP seexpresa de manera independiente; sin embargo, e interesantemente, observamosque la proteina quimera Tyrobp-GFP tiene una distribución celularcaracterística coincidente con la observada en preparados de inmunohistoquímicacontra Tyrobp en la microglia de cerebro de roedores y humanos. Debido a quelos LV se integran al genoma celular, las BV2 transducidas mantienen laexpresión transgénica por lo tanto se establecen dos nuevas líneas celularesmicrogliales que sobreexpresan constitutivamente Tyrobp.CONCLUSIONES: El envejecimiento en la rataSD está marcado por una pérdida de capacidad de aprendizaje y memoria espacial,que correlaciona a nivel hipocampal con un aumento de la reactividad microglial.Esto se corresponde con un aumento de genes proinflamatorios, entre ellos elgen de la proteína Tyrobp. Futuros estudios en las líneas celulares BV2generadas en este trabajo permitirán dilucidar el impacto de Tyrobp en lascélulas microgliales asociado al envejecimiento cerebral y a las enfermedadesneurodegenerativas.