Conjugacion de nanoparticulas fluorescentes a vectores adenovirales

SCHWERDT JI; REGGIANI PC; GOYA RG

Mendoza

Simposio; SIMPOSIO Sistema Neurondocrino: Fisiología Reproductiva, Patología y Envejecimiento.; 2009

IMBECU-CCT-CONICET

La terapia génica ha experimentado un desarrollo explosivo en los últimos años. Si bien su asociación con la nanotecnología se encuentra todavía en un estadio seminal, se prevé que en pocos años esta conjunción podría llevar al desarrollo de herramientas nanomédicas de muy alta performance. En particular, la conjugación de nanocristales semiconductores fluorescentes (conocidos también como quantum dots o qdots) a diferentes moléculas biológicas con el fin de visualizar procesos celulares y moleculares in vivo e in vitro, ha alcanzado un desarrollo significativo en los últimos años. Los qdots presentan varias ventajas respecto de las proteínas y fluoróforos orgánicos, como ser una vida media de emisión mucho más larga, mayor luminiscencia y estabilidad. Resulta de interés conjugar qdots a vectores adenovirales (RAd) a fin de facilitar la visualización de las células transducidas por dichos vectores. Esto es de particular importancia para el caso de transgenes terapéuticos que expresan péptidos difíciles de identificar por inmunohistoquímica o métodos bioquímicos de detección. Objetivo: Biotinilar la cápside del vector adenoviral RAd-(GFP/TK)fus, que expresa una green fluorescent protein (GFP) quimérica de alta fluorescencia verde, para luego conjugarle quantum dots 655-streptavidina. Las cápsides de los RAd-(GFP/TK)fus se biotinilaron con 134 µg/ml de EZ-Link® Photoactivatable Biotin (Pierce, USA) la cual posee un grupo nitrofenil azida previamente fotoactivado, responsable de la unión no específica de la biotina a las proteínas. La biotina excedente se eliminó por diálisis usando Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units de 10-100 µl de capacidad (Pierce, USA). Se empleó un ELISA para medir la eficiencia de biotinilación de los RAd. Los adenovirus biotinilados se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente con cantidad equivalente de Qdot 655 streptavidin conjugate (Quantum Dot Corp., USA). Posteriormente las muestras se procesaron con tinción negativa (ácido fosfotúngstico) para microscopía electrónica. Las absorbancias de las diluciones seriadas al ½ del RAd-(GFP/TK)fus biotinilado demostraron que la biotinilación fue exitosa. También se puedo observar que la diálisis no eliminó toda la biotina libre en exceso, sin embargo esta interferencia no alcanza a enmascarar la biotinilación del vector pues las absorbancias del RAd biotinilado son claramente superiores. Además, se observó sobre las cápsides de los RAd biotinilados la existencia de manchas densas que según interpretamos,  corresponden a los qdots, por su tamaño y forma. Por tanto, el uso de biotina fotoactivable proporciona un método fácil y rápido para la biotinilación de vectores adenovirales, pudiéndose medir la eficiencia de la reacción a través de un ELISA. Nuestro próximo objetivo será determinar si los vectores conjugados con qdots siguen manteniendo sus características funcionales y son por tanto, útiles para marcar las células transducidas por el vector.