Vectores virales de alta capacidad y magnetofección como tecnologías para la implementación de terapia génica y celular

SCHERDT JOSE I; GOYA RODOLFOG

Rosario

Congreso; Simposio sobre Regeneración y Muerte Celular Cardíaca: Nuevos Enfoques; Reunión anual de la Sociedad Argentina de Fisiología (SAFIS);; 2012

La terapia génica, que puede definirse como la transferencia de genes con fines terapéuticos, es una metodología de creciente interés en medicina cardiovascular, particularmente en relación al tratamiento de la isquemia de miocardio. El desarrollo de la técnica denominada angioplastía coronaria transluminal percutánea (ACTP) permite un acceso físico de moderada invasividad a sectores coronarios específicos lo cual, combinado con la colocación intracoronaria de stents liberadores de droga, abre la posibilidad de administrar localmente vectores portadores de genes terapéuticos. Los vectores génicos constituyen también la base biotecnológica para la reprogramación de células somaticas a cardiomiocitos por transdiferenciación directa o a través de una inducción previa hacia  células pluripotentes que al igual que las células madre embrionarias, pueden se inducidas a diferenciarse en cardiomiocitos en presencia de moléculas inductoras apropiados. En esta presentación se describirá brevemente la estructura y función de diferentes tipos de vectores adenovirales que construímos y aplicamos en nuestro laboratorio, mencionándose también la técnica de transferencia génica asistida por campos magnéticos, que se basa en la asociación de vectores virales con nanopartículas magnéticas a fin de optimizar la transferencia génica en células en presencia de un campo magnético externo. En esencia, un vector adenoviral es un adenovirus que se ha modificado geneticamente para transportar el gen terapéutico que nos interesa transferir. Los vectores adenovirales más simples de construir son los denominados adenovectores de primera generación en los que se han delecionado del ADN viral los genes tempranos E1a y E1b, que son esenciales para la replicación del virus convirtiéndolos así en vectores replicación-deficientes. El espacio virtual en el genoma viral dejado por la deleción se utiliza para insertar un minicassette de expresión constituído por un promotor potente (generalmente de origen viral), el gen terapéutico y una secuencia terminal de ADN denominada señal de poliadenilación que facilita la traducción del mRNA del transgén. Los adenovectores de primera generación son relativamente simples de producir y se los puede purificar con alto título (hasta 1012 unidades formadoras de placa (pfu) /ml). Su mayor limitación es que los genes virales remanentes expresan proteínas que son reconocidas por el hospedante generándose en corto plazo una respuesta inmune que elimina las células transducidas por el vector y por consiguiente la producción del gen terapéutico. Por esta razón los adenovectores de primera generación son solo útiles para tratamientos de corto plazo (30-45 días). Un tipo más avanzado de vectores adenovirales son los denominados helper-dependent (HD) o evicerados pues en ellos se han delecionado todos los genes virales reemplazandolos por una ADN no codificante de relleno. En estos vectores de alta capacidad se pueden clonar sistemas multigénicos de gran tamaño (de hasta unos 25 Kbp, contra 8Kbp de los de 1º generación). Como los adenovectores HD no expresan genes virales son de muy baja inmunogenicidad y permiten la implementación de terapia génica de largo plazo (años).     Los vectores adenovirales más comunes poseen un único transgén y se encuentran bajo el control de un promotor viral constitutivo promiscuo, que es activo en virtualmente todos los tipos celulares. En nuestro laboratorio hemos construído sistemas génicos regulables bidireccionales y los hemos clonado en nuestros vectores adenovirales. Estos sistemas permiten la expresión simultánea de dos transgenes que se encuentran bajo el control de un promotor bidireccional regluable por el antibiótico doxiciclina que actua como un regulador inhibitorio. Generalmente uno de los transgenes codifica para una proteína fluorescente indicadora y el otro para un péptido terapéutico. Se discutirán las diferentes aplicaciones de los vectores descriptos.