Configuración de la apolipoproteína A-I ( LL5/2 en dHDL) fisiológicamente activa en la remoción de colesterol de células RAW

CUELLAR LA; PRIETO ED; CABALEIRO LV; GONZALEZ MC; GARDA HA

La Plata

Jornada; Jornadas de la Facultad de Ciencias Médicas; 2010

Facultad de Ciencias Médicas- Universidad Nacional de La Plata

Introducción: Las lipoproteínas discoidales de alta densidad (dHDL) son intermediarios fundamentales en el eflujo lipídico  de las células  mediado por la apolipoproteina A-I. En la actualidad se conoce que estos complejos se originan en aquellos estudios donde se utilizó dHDL reconstituída por diálisis con detergente (1), aunque ellos también pueden surgir de la reacción espontánea de apoAI con las vesículas fosfolipídicas a temperatura de transición de fase, que es un procedimiento similar a la lipidación “in vivo” de la apoAI. Es muy conocido que la dHDL consiste en una bicapa lipídica discoidal rodeada por dos moléculas anti-paralelas a la apoAI con sus hélices perpendiculares a las cadenas hidrocarbonadas de los lípidos. En la dHDL obtenida por diálisis de colato, Silva et al. (2) detectaron dos ordenamientos co-existentes: Uno con la hélice-5 de cada molécula de apoAI en yuxtaposición (LL5/5) y la segunda con la hélice-5 de la molécula apoAI en yuxtaposición con la hélice 2 (LL5/2). Con el propósito de comparar la configuración de apoAI en la dHDL generada espontáneamente con la de la dHDL obtenida por diálisis con detergente, medimos algunas distancias intermoleculares   por transferencia de energía de fluorescencia usando dos únicos mutantes de triptófano (W@104 y W@108) y tres mutantes de cisteína marcada con Alexa-488 (K107C, K133C y K226C).  Los resultados corroboran la coexistencia de ambas configuraciones en la dHDL producida por diálisis de colato, pero también señalan que únicamente la configuración LL5/2 está presente en la dHDL generada espontáneamente. Además, la dHDL producida espontáneamente es más activa que la preparada por diálisis con detergente al promover el eflujo del colesterol de las células, señalando que únicamente la configuración LL5/2 es funcional. Como lo hemos sostenido anteriormente, los pares centrales de la hélice 3-4 forman un ramillete intermolecular que se inserta en la membrana y que es posible en la configuración LL5/2, pero no en la LL5/5. Objetivos: Comparar la configuración de apo AI en la dHDL generada espontáneamente con la de la dHDL obtenida por diálisis con detergente fue necesario construir tres mutantes de cisteína (K107C, K133C y K226C), las que fueron marcadas con Alexa-Fluor 488. Evaluar la remoción del colesterol en células RAW por parte de la configuración adoptada por la Apo A-I en formación de dHDL en reconstitución espontanea o con colato. Materiales y Métodos: Construcción y marcación de mutantes: Las mutantes se obtuvieron por mutagénesis sitio dirigida y purificaron por cromatografía de afinidad por Ni luego de su expresión en bacterias. Estas se marcaron con Alexa Fluor-488 C5-maleimida. Del espectro de absorción, se determinó una estequiometría de marcado de 1:1 ± 10%. El mismo tratamiento en apo AI salvaje indicó que el marcado inespecífico fue < 5%. Preparación de dHDL: Vesículas multilamelares de DMPC se incubaron a 24 °C con las proteínas en una relación molar de 40/1. Luego de 8 horas, ciclos de temperatura por encima y debajo de Tt se usaron para homogeneizar el tamaño de las dHDL, el que fue estimado en 10 nm por PAGGE. Análisis de eflujo de colesterol de las células RAW: las células utilizadas en este trabajo fueron  RAW 264,7 estas son  macrófagos de ratón  línea celular leucémica.  Estas células fueron tratadas durante 24 h en un medio con albúmina sérica bovina (2 mg / ml), colesterol (50 mg / ml), 14 [C]-colesterol (0,05 μCi / ml), con 8-bromoadenosine-3-5 -mono fosfato cíclico (Br-AMPc) (0,5 mM) durante 8 h y  Br-AMPc durante 12 h. Resultados  y conclusiones: La caracterización de los mutantes apo AI cys  marcada o sin marcar con el grupo fluorescente Alexa indica que se pliegan de la misma manera  a la Apo recombinante.  Ni la mutación ni el grupo fluorescente incorporada afecta  la capacidad de generar de manera espontánea dHDL en la reacción con vesículas DMPC a la temperatura de transición de fase. Los resultados obtenidos con la proteína marcada en la posición 226, sin embargo, son más compatibles con el acuerdo 5 / 5. Con independencia de la organización en el dominio C-terminal reportado por la mutante 226 de la proximidad intermolecular entre los residuos 107 y 133 detectado en este trabajo, indica que la hélice 3-4 de cada molécula de  apoAI se encuentra muy cerca dHDL generados espontáneamente, esta proximidad permitiría la formación de un par de hélice intermoleculares,  lo que explica sus propiedades de inserción en la membrana y el hecho de que sólo estos dHDL están activos en la remoción de colesterol en las células.