CONICET | Buscador de Institutos y Recursos Humanos

Los sistemas de co-cultivos se utilizan con frecuencia para estudiar la interacción entre distintos tipos de células, que resulta de interés en el estudio de los procesos de invasión y colonización, como en el desarrollo de nuevos materiales, donde se requiere disponer de selectividad para activar determinada funcionalidad en cierto tipo celular respecto a otro. En esta contribución se proponen distintos arreglos experimentales de co-cultivo. Se utilizan células pre-osteoblásticas MC-3T3-E1 de ratón y células tumorales T47D de cáncer de mama humano, que se cultivan en medio RPMI suplementado con suero fetal bovino y antibiótico, en incubadora a 37 ºC y atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Se emplean tres arreglos experimentales con las dos líneas celulares mencionadas en co-cultivo: a) los pre-osteoblastos MC-3T3-E1 y las células tumorales T47D se siembran juntas sobre superficies adherentes de poliestireno y se sigue mediante microscopia óptica la evolución de los patrones morfológicos y la magnitud de la proliferación celular; b) las células MC-3T3-E1 se cultivan en medio suplementado con medio condicionado, proveniente del cultivo de células T47D en medio sin suero fetal bovino; c) se fabrican frentes inicialmente quasi-lineales que se propagan en la dirección perpendicular al frente. Los frentes de las dos líneas se generan empleando máscaras de TeflónR para definir el área inicial deseada de cada colonia celular sobre el substrato y utilizando un tabique móvil de TeflónR que separa ambas colonias y cubre el espacio común que colonizarán las células. La siembra de cada línea celular se realiza en la zona libre de TeflónR y luego de 2-3 días,cuando los cultivos alcanzan la confluencia deseada, se retiran las máscaras y el tabique y las células de cada tipo se propagan en dirección opuesta sobre el substrato de poliestireno. En todos los experimentos, se siembra un número 5 veces mayor de preosteoblastos que de células T47D. Se sigue la evolución de los frentes de crecimiento durante una semana aproximadamente. El diseño experimental c) permite analizar la evolución del patrón morfológico de las colonias que avanzan, y determinar la velocidad de propagación promedio como también la dinámica de "arrugosado" de los frentes de las colonias. El arreglo experimental presentado en a) y b) también se emplea en este trabajo para evaluar la expresión de fosfatasa alcalina (ALP) producidas por las células MC-3T3-E1 solas o en presencia de medio condicionado y/o células T47D. Ocasionalmente se siguen los distintos cultivos en un sistema de observación continua in vivo, empleando una cámara que simula las condiciones de una estufa de cultivo. La tasa de proliferación de las células MC-3T3-E1 disminuye en presencia de células T47D o en medio condicionado proveniente de las células tumorales. Además, el área promedio de las células pre-osteoblásticas se hace más pequeña y la morfología más "ahusada" y con la presencia de largos filopodios. Para tiempos de cultivos relativamente más largos, la morfología de los co-cultivos se asemeja a la de las células T47D sembradas solas sobre el substrato de poliestireno. La expresión de fosfatasa alcalina, determinada a los 15 días de la siembra en distintas concentraciones de medio condicionado + medio de diferenciación, indica una disminución de la diferenciación osteoblástica al aumentar la concentración del medio condicionado. Los resultados obtenidos empleando el arreglo experimental descripto en c) indican que la velocidad depropagación del frente de las colonias de células pre-osteoblasticas decrece con el tiempo de cultivo, en tanto que la del frente de células T47D, permanece constante dentro del error de medida. Ambas células exhiben contacto físico, particularmente en el frente de propagación, y se puede distinguir además, aspectos característicos del desplazamiento de las colonias de cada línea celular: los pre-osteoblastos poseen una mayor movilidad que lasT47D, aunque estas últimas tienen la capacidad de desprenderse desde "clusters" con un número crítico de células, para formar sub-colonias distantes. Considerando los distintos arreglos experimentales, se observa que los cambios en las propiedades y funciones de las células pre-osteoblásticas se deben principalmente a los factores solubles liberados por las células T47D presentes en el medio condicionado. El arreglo experimental propuesto en este trabajo puede resultar útil para obtener una mejor descripción de los procesos de invasión y colonización celular.