Nanopartículas de silicio: síntesis, caracterización, efecto de la irradiación e incorporación a células tumorales

MANUEL J. LLANSOLA PORTOLÉS; NATALIA I. GARABANO,; PEDRO M. DAVID GARA,; FELIPE J. RODRIGUEZ NIETO; BEATRIZ SORIA; DANIEL O. MÁRTIRE; OSCAR R. CASAS; MÓNICA L. KOTLER; MÓNICA C. GONZALEZ

San Miguel de Tucumán

Congreso; XXVII Congreso de la Asociación Química Argentina.; 2008

AQA

Las nanopartículas de silicio (NP-Si) con tamaños comprendidos entre 1 y 5 nm exhiben fotoluminiscencia debido al efecto del confinamiento cuántico. La longitud de onda de la excitación y el espectro luminiscente es función del tamaño y de la naturaleza química de la superficie. Dichas propiedades las convierten en herramientas aptas para diversas aplicaciones biológicas. Se ha optimizado el método de síntesis electroquímica y de purificación de las NP-Si. Se ha logrado derivatizar las NP-Si con metacrilato y metanol, con la consecuente modificación de su superficie y por lo tanto de sus propiedades. Las diferentes NP se han irradiado con rayos-X a dosis variables, del orden empleado en radioterapia y se han analizado los cambios en su luminiscencia y los espectros FTIR. Se ha demostrado la incorporación a celulares tumorales de NP-Si comerciales y derivatizadas en metanol (NP-Si-OMe). Los cambios morfológicos producidos por efecto de las NP-Si se analizaron mediante microscopía de contraste de fase y la incorporación de las NP-Si, mediante espectrofluorometría y microscopía de fluorescencia. La síntesis de las NP-Si se realiza partiendo de obleas de silicio (n-type) de orientación cristalográfica <100>. La oblea se sumerge en el electrolito (H2O; CH3OH; HNO3; HF) a una velocidad constante, requisito necesario debido a que la mayor densidad de corriente pasa por la interfase aire-electrolito. La síntesis se realiza durante 24 horas con corrientes comprendidas entre 1 y 20 mA/cm. Una vez completado el proceso, las NP-Si quedan adheridas a la oblea de silicio. Para separarlas de la misma, colocando la oblea en un vaso con tolueno y liberándolas al solvente de manera mecánica mediante ultrasonido. Las NP-Si sintetizadas tienen un centro de silicio con una monocapa de hidrógenos en la superficie. Este recubrimiento es muy inestable en medios oxidantes, observándose la oxidación superficial de las partículas. Para estabilizarlas se las somete a un tratamiento por calor a 90º C durante 6 horas en presencia de metil metacrilato. Al final del proceso quedan las NP-Si recubiertas con cadenas de metil metacrilato. Estas NP-Si son estables al resuspenderlas en agua con menor pérdida de la luminiscencia. Para realizar los espectros infrarrojos, se evapora el solvente y se preparan pastillas con KBr. Espectros IR tomados inmediatamente después de la síntesis y optimizando las condiciones experimentales de forma de prevenir la oxidación, muestran la presencia de bandas asignables a enlaces Si-H. En la figura se muestran partículas parcialmente oxidadas y derivatizadas con metanol. Los picos a 2918 y 2849 cm-1, asignados a enlaces C-H confirman la presencia de cadenas hidrocarbonadas en la superficie. En el gráfico se muestran los espectros de la oblea de Si (línea verde), de las NP-Si con el porta muestras como referencia (línea roja) y de las NP-Si con a la oblea de Si como referencia (línea rosa). Las suspensiones de NP-Si con diferentes recubrimientos superficiales se irradiaron de manera que pudieran recibir una dosis absorbida del orden del empleado en pacientes con esquemas de fraccionamiento estándar (2 Gy). Los valores de dosis estudiados fueron 1, 2 y 3 Gy. Para ello se utilizó un acelerador lineal de electrones Varian Clinac con un potencial de aceleración nominal de 4 MeV. Los espectros de emisión de las NP-Si irradiadas se obtuvieron con un espectrofluorómetro Perkin Elmer LS50B. Las suspensiones acuosas de NP-Si comerciales y sintetizadas, con distintos recubrimientos superficiales se excitaron a longitudes de onda entre 300 y 370 nm, con incrementos de 10 nm y entre 220 y 320 nm, con incrementos de 20 nm respectivamente. Todos los espectros de emisión se tomaron en el rango entre 300 y 600 nm. En general, en el caso de las distintas NP sintetizadas, los perfiles de los espectros de emisión no se modifican con la dosis de irradiación recibida, mientras que la intensidad máxima de fluorescencia se ve alterada por la dosis. En el gráfico se muestra la variación en la intensidad del pico máximo de fluorescencia con la dosis de radiación recibida, para las NP-Si sintetizadas desnudas y derivatizadas en metacrilato.Las NP comerciales, en cambio, presentan modificación tanto en el perfil como en el máximo de intensidad en función de la dosis recibida. Las células C6 de glioma murino y MCF-7 de carcinoma mamario humano se cultivaron en medios DMEM y DMEM-F12 respectivamente. Los cultivos en monocapa fueron mantenidos a 37ºC con 5% CO2 hasta lograr una confluencia del 75%. Luego, las células se incubaron durante 2hs con una suspensión acuosa de NP-Si (previamente sonicada durante 2hs) a una concentración final de 10 μg/ml, en el medio correspondiente deprivado de suero. La incorporación de NP a las células se verificó mediante espectrofluorometría y la observación morfológica se realizó empleando un microscopio óptico de contraste de fase Nikon Eclipse TS100. Se obtuvo una respuesta diferencial según la estirpe celular: las células MCF-7 incubadas con NP-Si presentaron cambios morfológicos con eventos característicos de muerte celular necrótica, en tanto que el mismo tratamiento en las células C6 no produjo modificaciones.Las células C6 se incubaron con una suspensión acuosa de NP-Si-OMe (previamente sonicadas durante 15min) a una concentración final de 1μg/ml. En este caso, la incorporación de NP se analizó mediante microscopía de fluorescencia empleando un microscopio Nikon Eclipse E600 acoplado a una cámara digital CoolPix5000. Se observa un aumento en la incorporación de NP en función del tiempo de incubación. A 2hs, las células presentaron citoplasma fluorescente, principalmente en la región perinuclear. A 4hs, la fluorescencia aumentó en intensidad y comenzó a detectarse traslocación de NP al núcleo la cual resultó más evidente luego de 6hs. El análisis microscópico no mostró evidencias de alteraciones morfológicas. Los mismos estudios se están realizando con células de la línea MCF-7. CONCLUSIONES: Se optimizó la síntesis de NP-Si con bandas de absorción y de emisión dentro del espectro visible, lo cual resulta de gran utilidad para su posible aplicación como marcadores biológicos. Se modificó exitosamente la superficie de las NP-Si con distintos grupos funcionales, lo que le confiere mayor estabilidad en suspensión acuosa y permite diseñar a futuro otras derivatizaciones para diversas aplicaciones biológicas. La irradiación de las suspensiones de NP-Si con rayos X altera su intensidad de fluorescencia, lo cual sugiere una modificación de su superficie. Similares resultados se han descripto para la irradiación UV de NP-Si derivatizadas1. Se continúa avanzando en el análisis de los espectros FTIR de NP irradiadas para confirmar esta hipótesis. La citotoxicidad detectada en las células MCF-7 puede deberse a la oxidación que las NP-Si comerciales presentan en superficie, lo cual está descripto para las nanopartículas de SiO2 La incorporación de las NP-Si-OMe al citoplasma y núcleo de las células C6 se evidenció por un aumento de la intensidad de fluorescencia de manera tiempo dependiente.