Fotogeneración y caracterización de dímeros de tirosina, marcador de daño oxidativo

CASTAÑO, CAROLINA; REID, LARA O.; DANTOLA, MARIA LAURA; THOMAS, ANDRÉS H.

San Miguel de Tucumán

Congreso; Tercera Reunión de Fotobiólogos Moleculares Argentinos; 2016

Universidad Nacional de Tucumán

IntroducciónEn la actualidad, las modificaciones químicas o estructurales que sufrenlas proteínas son utilizadas como marcadores de diferentes procesos relacionadoscon el envejecimiento, el estrés y patogénesis.1 Las alteracionesque sufren estas biomoléculas tienen lugar principalmente en los residuos decisteína, metionina, triptófano, tirosina (Tyr) e histidina. Se ha reportadoque el cross-linking en las proteínaspuede ser mediado por dímeros de tirosina (Tyr2), los cuales puedenser generados por diferentes mecanismos, entre ellos, los procesosfotosensibilizados. En los últimos años se ha tenido un especial interés en detectarla formación de Tyr2, ya que esta modificación en particular seasocia con situaciones patológicas y anormales.2 En la literatura lainformación disponible acerca de las características fisicoquímicas y fotofísicasde esta molécula es escasa. Teniendo en cuenta la importancia biomédica delestudio de los Tyr2, el principal objetivo de este trabajo es generar,aislar y caracterizar Tyr2 en solución acuosa. Se eligió Pterina (Ptr)como fotosensibilizador pues es una molécula que bajo radiación UV-A es  fotoestable, capaz de generar dañofotoinducido en ADN, proteínas y sus componentes.3,4 Cuando la Tyrlibre es expuesta a radiación UV-A en presencia de Ptr, se generan distintosproductos de oxidación, entre ellos los Tyr2.3Materiales y MétodosSoluciones acuosas aireadas de Tyr (Sigma Chemical Co.) en presencia de Ptr (SchircksLab.) fueron expuestas a radiación UV-A (λexc: 350nm) durante un períodode tiempo. Los Tyr2 generados fotoquímicamente se aislaron del resto de los productosusando la técnica de HPLC preparativo. Elestudio fisicoquímico de los Tyr2 se realizó utilizando técnicas tales como espectrofotometría UV/visible,fluorescencia estacionaria y resuelta en el tiempo (TCSPC), HPLC con detecciónde absorbancia y fluorescencia, detección enzimática colorimétrica de laproducción de peróxido de hidrógeno.Resultados yconclusionesEl pKa de los Tyr2  se determinó por espectrofotometría UV/VIS arrojandoun valor de 7,25±0,02. El análisis del espectro de emisión de esta molécula muestrauna banda ancha en la zona visible del espectro con un máximo de emisióncentrado en 408nm el cual es independiente del  pH de la solución. El análisis por la técnicaTCSPC de las muestras a distintos pH revela que existe un único tiempo de vidade fluorescencia (4,5 ns). Los rendimientos cuánticos de fluorescencia a pHácido y alcalino son 0,25 y 0,46, respectivamente. El estudio de lafotodegradación de los Tyr2 a pH ácido (λexc: 280nm) y alcalino (λexc:320nm),revelan que la forma ácida es fotoquímicamente más estable.  Referencias                                                                                 1Davies,K., J. J. Biol. Chem. 262, 9895, 19872Malencik,D. A., Anderson,S. R., Biochemistry, 26,695, 19873Castaño,C., Dantola, M.L., Oliveros, E., Thomas, A.H., Lorente, C., Photochem. Photobiol.,89, 1448, 20134Thomas, A. H., Lorente,C., Roitman,K., Morales,M.M., Dántola,M.L., J.Photochem.Photobiol. B, 120, 52, 2013