SISTEMAS BIFÁSICOS ACUOSOS PARA LA PURIFICACIÓN DE CATALASA FÚNGICA A PARTIR DE CULTIVOS DE Aspergillus niger

BRASSESCO, MARÍA EMILIA; WOITOVICH VALETTI, NADIA; BELLUZO, MARÍA SOLEDAD; PICÓ, GUILLERMO

Rosario

Jornada; VII Jornadas de Ciencia y Tecnología; 2013

Universidad Nacional de Rosario

Uno de los desafíos de la bioseparación es la obtención de enzimas de interés a partir de una fuente natural compleja. El principio de extracción liquido-liquido utilizando Sistemas Bifásicos Acuosos es una herramienta poderosa empleada como una alternativa para purificar proteínas ya que presenta ciertas ventajas como su bajo costo y sencillez, permitiendo además la regulación de pH o fuerza iónica y pudiendo integrar en un solo paso extracción, clarificación, purificación y concentración del material de interés. El objetivo de este trabajo fue la obtención de la enzima catalasa (CAT), enzima de gran importancia por su aplicación en diferentes bioprocesos, a partir de un cultivo fúngico de Aspergillus niger y su posterior purificación por medio de sistemas bifásicos acuosos polietilenglicol/fosfato de potasio (PEG/Pi). Para ello se estudiaron las siguientes variables significativas: Peso molecular del polímero (PEG 400-8000), longitud de la línea de unión (LU 1-4), relación de volúmenes entre fase superior e inferior (Vsup/Vinf 0,3-2), concentración de NaCl (ccNaCl 0-10% p/p) y agregado de un ligando de afinidad (Polietilenimina ?PEI). La enzima CAT (intracelular) fue obtenida a partir de un cultivo de A. niger en un medio específico, y liberada por disgregación mecánica del cultivo. Se midieron actividad catalasa (absorbancia a 240 nm por descomposición de H2O2) y concentración de proteínas totales por el método de Warburg en todos los SBA ensayados. Para cada fase de los sistemas ensayados se determinaron los coeficientes de reparto (Kr), el rendimiento (R%) y el factor de purificación (FP). Los experimentos realizados indican que los mejores resultados se obtienen para los SBA de menor peso molecular (PEG 400 y 600) y LU, recuperando en todos los casos la enzima en la fase inferior del sistema. En cuanto al efecto de la relación de volúmenes, tanto para los sistemas PEG400/Pi como para PEG600/Pi la enzima se recuperó en la fase inferior, obteniéndose el mejor rendimiento para la menor relación ensayada (Vinf/Vsup=0,3). Posteriormente se llevaron a cabo ensayos modificando la fuerza iónica por agregado de diferentes concentraciones de NaCl. En este caso se observó que tanto el rendimiento como el factor de purificación de CAT aumentan conforme aumenta la [NaCl] en el medio, obteniéndose asimismo la enzima en fase inferior. Finalmente se evaluó el agregado de la PEI como ligando de afinidad para la separación de CAT. Los resultados indican que con este ligando es posible mejorar el rendimiento de recuperación en fase inferior cerca de un 10% hasta cierta concentración de PEI (4% p/p), por encima de la cual el rendimiento se mantiene constante. En conclusión, utilizando las mejores condiciones ensayadas fue posible purificar CAT fúngica a partir de su fuente natural utilizando SBA, con R mayores al 80% y FP cercanos a 3.