Método simple para producir y aislar una enzima estratégica por su empleo en biotecnología: la catalasa fúngica

BRASSESCO, M.E.; MAGLIONE, M.V.; WOITOVICH VALETTI, N.; BELLUZO, M. S.; PICÓ, G.A.

Rosario

Congreso; XV Congreso y XXXIII reunión anual de la sociedad de biología de rosario; 2013

Las catalasas (CAT) están presentes tanto en animales como en vegetales. Industrialmente, es producida a partir de hongos, siendo Aspergillus uno de los géneros más utilizados para su producción. La CAT utiliza como sustrato el peróxido de hidrógeno, al cual reducen a H2O y O2. Son empleadas en diversos procesos biotecnológicos: eliminación de restos de agua oxigenada en plantas pasteras, líquidos limpiadores de lentes de contacto, etc. El objetivo general de este trabajo fue desarrollar una metodología sencilla y económica para obtener CAT a partir de un cultivo fúngico. El mismo se logró a partir de dos objetivos parciales: a) desarrollar cultivos del hongo Aspergillus niger en un medio específico para inducir la producción de CAT y b) recuperar la CAT a partir de la biomasa fúngica, este último se llevó a cabo mediante extracción empleando un sistema bifásico acuoso (SBA) de polietilen glicol (PEG) - fosfato de potasio. La elección de los SBA se basa en que los mismos estabilizan a las enzimas, son amigables con el medio ambiente y sus componentes se pueden reciclar. Se estudió el reparto de la CAT en SBA utilizando PEG de diferentes pesos moleculares (desde 400 hasta 6000), a dos pH: 5,8 y 7,0, en presencia de diferentes concentraciones de NaCl, diferentes relaciones de volúmenes de cada fase y diferentes proporciones de biomasa. La CAT posee un peso molecular de 396kD, con un pH isoeléctrico de 6.5. Debido a su elevada masa molar, es de suponer que la CAT será excluida de la fase rica en PEG. Los resultados obtenidos mostraron que en PEG400 la constante de reparto de la CAT es de 4,0 mientras que en un medio de PEG1500 es de 0,5 observándose un valor de 2,0 en PEG6000. Este comportamiento anómalo está demostrando que el volumen excluido de la CAT no es el único efecto que conduce el reparto de la enzima, ya que debería disminuir en forma monótona al aumentar el peso molecular del PEG. Se supone que por su elevado peso molecular la enzima posee numerosos parches hidrofóbicos en contacto con el solvente, lo que favorece su interacción con el PEG. En el caso de PEG6000 debido a la forma de ovillo que adquiere su molécula, es más fácil llegar al dominio de la CAT de manera que aumenta la interacción. El reparto fue endotérmico entre 20ºC a 30°C, confirmando el desorden del agua. En conclusión, se logró producir CAT a partir de un cultivo de Aspergillus niger y se determinaron las condiciones óptimas de reparto de dicha enzima utilizando SBA con el objetivo de desarrollar una técnica de purificación de la misma. Las mejores condiciones para el reparto fueron: una relación de volúmenes entre fase inferior y superior de 0,3, utilizando PEG400 o 600 a pH 7,00 y agregando al medio una concentración de NaCl del 10%. En dichas condiciones se obtuvieron rendimientos del 80% y factores de purificación cercanos a 3.