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En este trabajo presentamos el desarrollo de nuevas estrategias de tipificación molecular utilizando las metodologías Luminex y PCR en Tiempo-Real con sondas Taq-Man, que discriminan los cuatro grupos principales de T.cruzi: Grupo 1, son los organismos denominados de Tc I;Grupo II, incluye Tc IIb e hibridos Tc IId y IIe; Grupo III, incluye organismos Tc IIa y Grupo IV organismo del grupo IIc. Ambos ensayoscombinan la sensibilidad de la PCR con la especificidad de la hibridización de sondas específicas para discriminar las mencionadas poblacionesparasitarias. Sondas y primers complementarios a secuencias específicas de la región intergénica del mini-exón de cada grupo, fueron diseñadosa partir del alineamiento de 26 secuencias representativas de la heterogeneidad genotípica de T. cruzi, disponibles en el Gene Bank. Los tractoscon estructura secundaria estable fueron descartados para el diseño de sondas. La amplificaciòn se realiza por PCR Multiplex utilizando un primerforward común y primers reverse específicos de cada grupo. Los amplicones obtenidos se distingen mediante sondas específicas por Luminexo PCR en Tiempo-Real. El Luminex es una metodología novedosa que acopla microesferas con concentraciones distintas de dos colorantesa sondas de ácidos nucleicos. Las microesferas son reconocidas por dos detectores láser utilizando tecnología análoga a la citometría de flujo,permitiendo discriminar entre 100 microesferas acopladas a sondas que pueden hibirizar específicamente de forma simultánea a los ampliconesproducidos por la PCR. Hemos diseñado y evaluado 10 sondas distintas para identificación de secuencias del mini-exon de los cuatro gruposde T. cruzi, y una secuencia heteróloga clonada en plásmido como control interno del procedimiento. Las sondas diseñadas para Luminex quemejor afinidad presentaron por el amplicón especifico de cada grupo de T. cruzi, fueron modificadas para detectar dichos amplicones por PCRen Tiempo-Real, utilizando sondas Taq-man. La especificidad de las sondas diseñadas para cada tipo de ensayo fue confirmada utilizando ADNde cultivo de stocks de referencia para cada grupo de T. cruzi. La sensibilidad fue evaluada en muestras de sangre reconstituida, obteniéndoseun límite de detección de 5 parásitos/mL para ambos ensayos. El objetivo final de este enfoque es el análisis directo de muestras biológicas, queserá puesto en marcha una vez se optimicen las condiciones de mayor sensibilidad analítica y poder resolutivo de ambas metodologías actualmenteen evaluación.