Presencia y posible funcionalidad de la Poli (ADP-ribosa) polimerasa en el nucléolo de T. cruzi

FERNÁNDEZ VILLAMIL SH; KEVORKIAN ML; VILCHEZ LARREA SC

Resistencia

Congreso; XXX Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2018

La Poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) de Trypanosoma cruzi (TcPARP) participa en la respuesta celular ante el daño genotóxico modificando covalentemente proteínas aceptoras tras la adición de cadenas de polímeros de ADP-ribosa (PAR). A diferencia de la localización nuclear de hPARP1 en mamíferos, TcPARP transloca del citoplasma al núcleo ante el estímulo generado por estrés oxidativo, evidenciando la formación de PAR. En eucariotas superiores PARP se encuentra enriquecida en el nucleolo participando en la regulación del procesamiento del rRNA y el sensado de estrés por daños en el DNA. En T. cruzi, aún no se ha estudiado la localización y el posible rol de TcPARP en este compartimento nuclear. Con el fin de determinar el dominio responsable de la acumulación nuclear de TcPARP, se generaron epimastigotes de T. cruzi que sobreexpresan diferentes combinaciones de dominios de la enzima, etiquetados con HA. Por inmuofluorescencia indirecta (IFI) se observó que la región N-terminal (NT) es suficiente para la localización nuclear y que la enzima completa recombinante (TcPARP-GFP) se comporta de manera equivalente a la nativa ante el tratamiento con H2O2 300 μM. Las proteínas sobreexpresantes TcPARP-GFP, el dominio NT y NT+WGR presentaron una mayor concentración de señal fluorescente en el nucleolo de los parásitos transgénicos y TcPARP-GFP co-localizó con un marcador nucleolar (L1C6), observado por microscopía confocal. A nivel funcional se evaluó, por IFI, la producción de PAR en epimastigotes transgénicos, en condiciones basales o tras la generación de estrés oxidativo, no evidenciando diferencias. Se hallaron a las proteínas recombinantes en un hilo conector entre núcleos, ya descripto en tripanosomátidos y compuesto por material nucleolar, donde también se encontró PAR en condiciones de estrés y co-localización con α-Tubulina. A través de la generación de curvas de crecimiento y de la citometría de flujo de parásitos sincronizados, marcados con Ioduro de Propidio, se comprobó que la sobreexpresión de dominios de TcPARP no altera el crecimiento de los epimastigotes. En conclusión, se determinó el dominio responsable de la localización de TcPARP en el núcleo y su enriquecimiento en el nucleolo. La presencia de PAR y la co-localización de los constructos con α-Tubulina en el hilo conector entre núcleos es una primer evidencia de la funcionalidad de TcPARP en el nucleolo de T. cruzi.