Estandarización y validación del uso clínico de la Reacción en Cadena de la Polimerasa para la detección de infección por Trypanosoma cruzi

HIJAR G; PADILLA C; BALBUENA J; BISIO MMC; BAILON H; VEGA S; CABEZAS C; NAQUIRA C; SCHIJMAN AG

Peru

Congreso; IX Congreso Peruano de Enfermedades Infecciosas y Tropicales "Jose Neyra Ramirez"; 2009

Sociedad Peruana de Enfermedades Infecciosas y Tropicales

Antecedentes: La enfermedad de Chagas es la causa importante de cardiomiopatía en América Latina, existen con alrededor de 100 millones de personas expuestas a la enfermedad. En la década de 1990, se estimo que 16-18 millones de personas fueron infectadas con el protozoario Trypanosoma cruzi, esta cifra ha sido revisada y se estima que existen 11 millones de personas infectadas, revelando una importante disminución en la prevalencia. En el Perú, existen zonas endémicas para esta enfermedad como en la región sudoccidental (Arequipa, Moquegua e Ica), de la región nororiental (Amazonas y Cajamarca) y recientemente un caso en la localidad de Pozuzo (Oxapampa-Junín). Los principales vectores importantes involucrados en la transmisión de la infección son Triatoma infestans y Pastronguilus herreri. Objetivo: Determinar la sensibilidad, especificidad y concordancia del PCR para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Materiales y métodos: Estudio descriptivo realizado en el Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular del Instituto Nacional de Salud.  La extracción del ADN empleado en la estandarización se realizó empleando un Kit de extracción comercial y la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) que se utilizó fue un PCR in house basados en el protocolo de Burgos y colab., 2007, con ciertas modificaciones. La amplificación fue empleada para la detección del kDNA de T.cruzi, como control positivo se utilizó ADN de la cepa T.cruzi y como control negativo ADN de sangre humana negativa para la infección con T.cruzi . Para la validación del PCR se analizaron 3 paneles de muestras a ciegas y por duplicado: Panel A: conformado por 3 controles negativos, 3 series de 5 diluciones cada una de ADN de cepas de T. cruzi pertenecientes a linajes I, II y III, este panel permitió evaluar el limite de detección. Panel B: 6 tubos con sangre no infectada reconstituida con diluciones al décimo de parásitos en cultivo, este panel permitió evaluar el limite de detección en parasito por mL de muestra; y el Panel C: 45 muestras sanguíneas con guanidina de individuos seronegativos y seropositivos para la enfermedad de Chagas, para evaluar la sensibilidad y especificidad de la prueba.  Estos paneles fueron enviados por el Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI) - Argentina dentro de las actividades del proyecto regional Standardization and validation of clinical use of PCR for Trypanosoma cruzi  DNA detection in Chagas disease.  Las muestras de estos paneles fueron previamente caracterizadas por serología y por técnicas moleculares. Resultados: El límite de detección del PCR  (Panel A) fue de 1 fg de ADN purificado y de 0,5 parásitos/mL (Panel B). Los valores de sensibilidad del PCR en relación a serología fue de  82.9% con IC95% (67.3-91.9%), la especificidad fue de 70% con IC95% (39.7-89.2%), el valor predictivo positivo 91% con IC95% (80.9-97.2%) y el valor predictivo negativo 54% con IC95% (30.0 – 70.0%). Los datos de concordancia entre el PCR realizado en INS y un PCR referencial realizado en Argentina (Met 28 -I) fue buena de acuerdo al análisis del índice kappa (0,6897) con error estándar de 0.1165, con un limite inferior de 0.4614 y un límite superior de 0.918. Conclusiones: Se ha estandarizado y validado una técnica de PCR in house para el diagnóstico de enfermedad de Chagas.  Esta prueba presenta una buena sensibilidad, especificidad y concordancia con una prueba de PCR referencial.  Por sus características esta prueba es útil para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas en el país.