Expresión de la proteína recombinante Wee-1 de Trypanosoma brucei en Leishmania tarentolae

COMINI MARCELO; BONILLA MARIANA; POTENZA MARIANA ; WEHRENDT DIANA; MARÍA TERESA TELLEZ-IÑÓN

Congreso; XXVIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2016

La proteína Wee-1 esuna quinasa de tirosina involucrada en la regulación de la transición G2/M delciclo celular eucariota. Recientemente en nuestro laboratorio se hacaracterizado la quinasa Wee-1 de Trypanosomabrucei (TbWee). Se ha visto que es necesaria para la progresión del ciclo celulary el crecimiento de los parásitos. Nuestro objetivo es expresar la proteína TbWeerecombinante en su forma activa para realizar estudios de función e identificarsus sustratos. Dado que la expresión de TbWee en un sistema procariota no fueexitosa, se decidió utilizar el sistema de expresión de Leishmania tarentolae. Al igual que T. brucei, L. tarentolae pertenece a la familia de tripanosomátidosy por lo tanto posee la maquinaria de modificación post-traduccional necesariapara que la proteína de interés expresada sea activa. Además, los parásitos L. tarentolae no son patogénicos para humanosy son de fácil manipulación. El sistema de L.tarentolae también permite una expresión inducible por tetraciclina, que esespecialmente útil cuando la sobreexpresión de la proteína de interés resultatóxica. Otra ventaja que este sistema ofrece es la co-expresión de la proteínafluorescente m-cherry junto con la proteína de interés, lo que facilita la selecciónde clones positivos. Una mayor expresión de m-cherry correlaciona con una mayorexpresión de la proteína de interés. La proteína TbWee fue clonada en el vectorde expresión de L. tarentolae con unaetiqueta de histidina para facilitar la detección con anticuerpos y lapurificación. Los parásitos fueron transfectados exitosamente porelectroporación e inducidos con tetraciclina por 24, 48 y 72hs para evaluar la expresión. Esto se realizó midiendo la fluorescencia de m-cherry en unespectrofotómetro. Resultados preliminares mostraron un aumento defluorescencia en los parásitos inducidos respecto al control no inducido.Además se observó una disminución de la expresión 72hs post-inducción. Pormicroscopía de fluorescencia se vio que dentro de la población transfectada seencuentran parásitos que expresan distintos niveles de m-cherry. Se realizaronentonces diluciones seriadas, para obtener una población enriquecida enparásitos de elevada expresión. Se están realizando ensayos de western blot einmunofluorescencia con el anticuerpo anti histidina para corroborar laexpresión de TbWee en estos parásitos. Financiación: CONICET yANPCyT (PICT 2012-2109).