Desarrollo de un método de cuantificación e identificación de linajes de Trypanosoma cruzi en muestras de sangre y tejido por PCR en Tiempo Real

DUFFY T, BURGOS JM, BISIO M, LEVIN MJ, SCHIJMAN AG.

IIB-INTECH, Chascomus, Buenos Aires, Argentina.

Congreso; XXII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología.; 2007

Introducción: La cuantificación precisa, sensible y específica de Trypanosoma cruzi en muestras biológicas es importante para evaluar la eficacia de nuevas drogas anti-tripanocidas y para seguir pacientes con reactivación chagásica por inmunosupresión. Objetivo: Desarrollar un método de cuantificación e identificación de los principales linajes de T. cruzi en sangre y tejido humano y murino por PCR en tiempo real (PCR-Q). Metodología: La secuencia nuclear satélite es utilizada como blanco por ser altamente repetitiva y contener regiones diferenciales entre T. cruzi I y T. cruzi II. Normalización de las muestras: 1) Sangre: se agrega a cada muestra 200pg de un plásmido y se calcula la eficiencia de la extracción al cuantificar por PCR-Q la masa de plásmido recuperada. 2) Tejido: se utiliza como referencia el número de células huésped, calculado al amplificar por PCR-Q  genes humanos o murinos de copia única. Resultados: Se montó una PCR-Q  de ADN de T.cruzi con una eficiencia > 95% en un rango dinámico de 0.01-105 parásitos/ml de sangre humana, que permite diferenciar Tc. I y Tc II por la temperatura diferencial de desnaturalización de sus amplicones. Este sistema fue evaluado en pacientes transplantados cardiacos con reactivación chagásica en sangre y tejido,  y en tejidos blanco de ratones infectados con cepas de laboratorio. Discusión: La validación del PCR-Q en estudios multicéntricos proveerá una herramienta valiosa para estudios clínicos e histopatológicos de la infección por T.cruzi.