Expresión transiente de GFP en callos emrbiogénicos de pasto miel, Paspalum dilatatum

GUITIAN, J.J.; RIVERO P., MARÍA MERCEDES; GHIO, SERGIO; MENTABERRY, A.N.; SCHRAUF, G.E.

Viña del Mar, Chile

Congreso; VI Encuentro Latinoamericano y del Caribe del Biotecnología Agropecuaria. REDBIO2007; 2007

Red de Cooperación Técnica en Biotecnología Agropecuaria para América Latina y el Caribe (REDBIO-FAO)

El pasto miel (Paspalum dilatatum Poir.), es una gramínea perenne de ciclo estival y alto valor forrajero, originaria de Sudamérica. El objetivo del presente proyecto fue poner a punto la transformación transiente, por biolística, de callos embriogénicos de pasto miel utilizando como gen reportero la secuencia codificante de la green fluorescent protein (GFP). Se trabajó con un cultivar apomíctico de pasto miel (cv Relincho). Se obtuvieron callos embriogénicos de Paspalum a partir de semillas maduras desinfectadas superficialmente con una solución de hipoclorito de sodio al 50% y desprovistas de tegumento bajo condiciones de esterilidad. Dichos explantos fueron cultivados en medio de inducción conteniendo macro, micronutrientes y orgánicos según la formulación de Murashige y Skoog (MS). El medio sintético MS fue adicionado con maltosa, 30 g/L y 2,4-D, 5 mg/L. Callos desdiferenciados y crecidos durante tres meses en medio de proliferación (MS, maltosa, 30 g/L y 2,4-D, 1,5 mg/L) fueron transformados por biolística utilizando el sistema de bombardeo con gas helio a alta presión (Aragão et al., 1996). Se ajustaron diferentes variables para la transformación por bombardeo de los explantos: distancia del material blanco (3 y 6 cm), presión de disparo (80 y 50 Bars) y tiempo de preincubación de los callos (3 y 4 h) en medio hiposmótico (medio de proliferación adicionado con manitol, 98, g/L). El material bombardeado fue observado en un microscopio confocal (Olympus FV300) 48 hs post-bombardeo. Las muestras fueron excitadas con un laser de argón de 488 nm. Se observó una alta eficiencia de transformación (número de células fluorescentes/ número total de células). En ninguno de los controles no transformados se observó fluorescencia debida a GFP. Al cabo de 5 semanas se obtuvieron embriones somáticos a partir de los callos bombardeados cultivados en medio de regeneración (MS con sacarosa, 30g/L y kinetina, 0,2 mg/L). Dichos regenerantes fueron separados y crecidos exitosamente in vitro hasta su rusticación. El objetivo ulterior del presente proyecto es obtener plantas de pasto miel resistentes a Claviceps paspali mediante la introducción por biolística de diferentes genes antimicrobianos.