Obtencion y caracterizacion de anticuerpos monoclonales recombinantes humanos anti-Trypanosoma cruzi

KA GÓMEZ

Montevideo

Simposio; Biologia Molecular de la Enfermedad de Chagas; 2012

Instituto Pasteur de Montevideo

Este trabajo se centra en el estudio del reconocimiento antigénico deanticuerpos monoclonales recombinantes humanos, fragmento variable de cadenasimple (scFv) anti-Trypanosoma cruzi, provenientes de pacientes con la EnfermedadCrónica de Chagas. Debido a la relevancia clínica de la respuesta inmunológica delos pacientes crónicamente infectados, se utilizó el concepto de display molecularque permitió la selección simultánea de genes que codifican para una proteína (laregión variable de genes de anticuerpos) con la especificidad hacia el antígenodeseado (unión a proteínas del parásito). Se construyeron 6 bibliotecas combinatoriales de anticuerpos scFv en el fagémidovector pHenIX-VSV, a partir de ARN total extraído de médula ósea ó sangreperiférica de pacientes con Cardiomiopatía Crónica de Chagas. El rastreo de lasbibliotecas utilizando la tecnología de Phage Display, permitió seleccionar dos scFvdenominados 6B6 y A2R1, que reconocen proteínas del parásito T. cruzi pormúltiples técnicas como: Western blot (WB), ELISA, inmunofluorescencia indirecta,citometría de flujo, inmunohistoquímica, e inmuno-oro. El scFv 6B6 mostróespecificidad hacia una proteína de T. cruzi, mientras que el scFv A2R1 reconociópor WB y ELISA, en lisados de otros kinetoplástidos y de cerebro de Mus musculusy Rattus norvegicus, una proteína de igual PM que la observada en T. cruzi.Además, por citometría de flujo e inmunofluorescencia indirecta, presentóreactividad contra líneas celulares de sistema nervioso de origen murino y humano.A partir de este resultado y, teniendo en cuenta que en la fase crónica de laenfermedad se desarrollan lesiones en el Sistema Nervioso Autónomo del paciente,se realizaron estudios de inmunohistoquímica sobre preparados de tracto digestivo ycerebro humano. El scFv A2R1 reconoció en ambos tejidos, el soma y lasprolongaciones de las células nerviosas. Con el fin de elucidar los epítopesreconocidos por ambos Acs recombinantes, se realizaron rastreos de bibliotecassintéticas de péptidos junto a un análisis biométrico, lo que permitió obtener péptidoscandidatos para la identificación de los determinantes antigénicos reconocidos porlos scFv, utilizando las bases de datos de las secuencias proteicas de T. cruzi, T.brucei y M. musculus. Es la primera vez que se utiliza esta metodología para elreconocimiento de epítopes de anticuerpos monoclonales humanos recombinantes,así como también bases de datos tan extensas como las anteriormente nombradas.Los resultados de esta Tesis muestran por primera vez la obtención, a partir debibliotecas de anticuerpos recombinantes, de un anticuerpo monoclonal humanoanti-T. cruzi con reactividad cruzada hacia proteínas del sistema nervioso periféricoy central, jerarquizando el posible rol de los anticuerpos auto-reactivos en lapatología de la Enfermedad Crónica de Chagas.